抗肿瘤药物含多柔比星结构新化合物STL的体外细胞抗肿瘤实验

张东明

摘要：恶性肿瘤造成大量生命危害甚至死亡，主要的治疗方法有：手术切除、化学疗法、放射疗法、基因疗法等，其中的化学疗法被广泛使用。但由于化学疗法使用的药物多属于细胞毒性药物，在治疗的同时严重地破坏组织的结构和功能，多不能连续长时间和大剂量使用，在临床上有明显的不良反应，严重地限制了化疗药物的使用，寻找强效低毒的化疗药物是医疗不断探索的课题。

含多柔比星结构新化合物STL（简称STL）是在多柔比星DOX的分子上加上一个敏感的靶向集团，构成了一个全新药物，其对正常细胞识别不强，可连续多次给药。本实验采用MTT法通过STL同多柔比星（DOX）在对体外细胞的抑制作用比较，结果表明对前列腺癌PC3效果良好。

关键词：含多柔比星结构新化合物STL，肿瘤，前列腺癌PC3

1.实验材料

1.1主要試剂：STL 天津斯涛利公司，DOX北京华奉联博公司，EDTA美国Gibco 公司，胰酶上海生物工程有限公司，PBS上海生物工程有限公司，二甲基亚砜（DMSO）上海生物工程有限公司。

常规试剂：75%乙醇，无水乙醇，氯化钠（NaCI），氢氧化钠（NaOH），氯化钾（KCI），磷酸二氢钾（KH2PO4），磷酸氢二钠（Na2HPO4），生理盐水，多聚甲醛等国产分析纯。

1.2 药物配制

STL的分子量为787，设置浓度为2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L，称取STL7.87mg，溶于10mL生理盐水中，配制成1000μmol/L的浓度，过滤后储存。

DOX的分子量为585，设置浓度为8μmol/L，称取DOX 5.85mg，溶于10mL生理盐水中，配制成1000μmol/L的浓度过滤后储存。

1.3试剂配制

1） PBS液配制：精确称取氯化钠（NaCl）8.0g，氯化钾（KCl）0.2g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.44g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）0.24g，在烧杯中用蒸馏水溶解，准确定容至1000mL，高压灭菌后储存。

2） DMEM液配制：取DMEM干粉培养基溶于超纯水中，磁力搅拌到充分溶解，加NaHCO3及双抗 ，震荡搅拌使之溶解，调节溶液pH值至 7.0～7.5，实验室超纯水补足至 1000 mL，用0.22 μmol/L 的滤膜过滤除菌，然后置于 4℃冰箱保存。用前加入胎牛血清调节至终浓度 10%。

3） MTT（5 mg/mL ） 液：精确称取MTT 500 mg，加入到PBS液 100 mL中充分溶解后，经 0.22 μmol/L的无菌滤膜过滤除菌，放置于-20℃保存。

4） 胰酶消化液配制：精密称取胰蛋白酶0.8克，置于100mL的D-Hanks液中，使溶胀完全，然后定容至800mL，得胰蛋白酶溶液。过滤除菌，4℃保存，备用。

2.实验方法

MTT比色法

含多柔比星结构新化合物STL对人前列腺癌PC3细胞的作用

2.1细胞复苏：

从液氮灌中取出冻存的装有前列腺癌PC3细胞的冻存管，投入37℃的水浴箱中，并轻轻震动使其尽快融化，开封，用过火的枪头吸出细胞悬液，注入到装有9mLPPS离心管中，用1200r/min 低速离心5min，除去上清液，加入DMEM清洗弃上清液，然后再加入DMEM，用枪头轻轻吹打至均匀散开使其成单细胞悬液，接种到培养瓶中，标记后放入到5%的37℃ CO2培养箱中，每日更换培养液。

2.2细胞传代：

弃去旧的培养基加5mLPBS清洗2次，洗去悬浮的死亡细胞，加入已经配制好的胰酶液，放到培养箱中消化细胞1min，取出镜下观察细胞漂浮后，加入5mLDMEM终止细胞消化，反复轻轻吹打均匀，使其成为单细胞悬液，用1200r/min 低速离心，5min，去除上清液，加入DMEM，反复吹打成单细胞悬液，然后分装到培养皿中，标记后培养。

2.3 MTT法诱导细胞凋亡实验：

1 收集对数期的细胞，调整细胞悬液的浓度，每孔加入100uL悬液，铺板使待测细胞密度 10000/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

2 5%CO2、恒温箱37℃孵育，至细胞在96孔板单层铺满孔底，加入梯度浓度的药物及阳性对照药物DOX浓度8μmol/L，药物浓度设置为2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L，每孔100uL，设3复孔。

3 5% CO2恒温37℃孵育72小时，倒置显微镜镜下观察。

4 每孔加入20uL MTT溶液（5mg/mL），继续培养4h。

5 终止培养，缓慢吸去孔内的培养液。

6 每个孔中加入150uL DMSO，放在摇床上振荡10min，观察蓝紫色的结晶物甲瓚充分溶解。使用酶联免疫检测仪在OD492nm处测量各组待测孔的吸光值。

7 同时根据以上设置调零孔（DMEM、二甲基亚砜、MTT）和对照孔（细胞、药物溶解质、DMEM、MTT、二甲基亚砜）。

3.含多柔比星结构新化合物STL对人前列腺癌PC3细胞的抑瘤效应

通过实验含多柔比星结构新化合物STL同DOX比较对人前列腺癌PC3细胞的抑瘤效应，给与2μmol/L-8μmol/L的不同浓度受试药物STL和8μmol/L浓度DOX，72小时各组别的作用：72小时STL组2μmol/L到8μmol/L组抑制率随着剂量增加抑制率增加，呈现剂量依赖性，相同给药剂量8μmol/L比较，STL抑瘤率28%明显高于DOX组19%（表1），STL对人前列腺癌PC3细胞的抑瘤率呈现随着剂量增加而增加的剂量依赖性。

实验总结

含多柔比星结构新化合物STL是在多柔比星DOX的分子上加上一个敏感的靶向基团，构成了一个全新药物，通过静脉注射给药，STL通过靶向基团与机体血液中的白蛋白结合在血液及正常的细胞环境下比较稳定，到达肿瘤组织后，由于肿瘤组织的特殊生长和代谢环境，靶向基团对其敏感，通过细胞摄取作用进入到肿瘤细胞中，释放出有细胞毒性的DOX，使肿瘤细胞凋亡，其实验结果及机理表明抗肿瘤作用优于多柔比星，是较DOX高效低毒的抗肿瘤药物。

（吉林省中医药科学院 吉林长春 130021）