ALA-PDT联合苋草苏合剂对尖锐湿疣HPVDNA含量的影响

曾庆山　吕运通　刁保忠　初瑞雪　张云平

[摘要] 目的 探討ALA-PDT联合苋草苏合剂对尖锐湿疣HPV DNA含量的影响。 方法 选取2018年6～12月于聊城市人民医院确诊的尖锐湿疣患者120例为研究对象，随机分为ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组和ALA-PDT对照组和苋草苏合剂对照组。治疗组应用ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗，对照组分别用ALA-PDT和苋草苏合剂治疗。收集治疗前和治疗2、4、8周后的病灶标本，利用PCR技术检测 HPV DNA 的含量。 结果 ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组和ALA-PDT对照组患者治疗2周后尖锐湿疣病毒含量均出现明显降低，两组比较差异无统计学意义（P>0.05），苋草苏合剂对照组患者治疗2周后尖锐湿疣病毒含量无明显降低，ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组和ALA-PDT对照组与苋草苏合剂对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗8周后ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组有53例患者HPV病毒含量转阴，ALA-PDT对照组和苋草苏合剂对照组分别有33例和18例患者HPV病毒转阴，ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组和ALA-PDT对照组和苋草苏合剂对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。ALA-PDT对照组和苋草苏合剂对照组两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。使用不同方法治疗三组患者后，其局部HPV病毒含量均较治疗前明显降低。 结论 ALA-PDT联合苋草苏合剂较单纯用ALA-PDT和单纯用苋草苏合剂能更有效地治疗尖锐湿疣，并能明显降低HPV病毒DNA的含量。

[关键词] ALA-PDT;苋草苏合剂;尖锐湿疣;PCR;HPV;DNA

[中图分类号] R752.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）21-0015-04

Effect of ALA-PDT combined with portulacae mixture on HPV DNA content of condyloma acuminatum

ZENG Qingshan1 LV Yuntong2 DIAO Baozhong2 CHU Ruixue2 ZHANG Yunping2

1.Shandong First Medical University， Tai'an 271016， China; 2.Liaocheng People's Hospital in Shandong Province， Liaocheng 252000， China

[Abstract] Objective To explore the effect of ALA-PDT combined with portulacae mixture on HPV DNA content of condyloma acuminatum. Methods A total of 120 patients with condyloma acuminatum diagnosed in Liaocheng People's Hospital from June to December 2018 were selected as the research subjects， and randomly divided into ALA-PDT combined with portulacae mixture treatment group， ALA-PDT control group and portulacae mixture control group. The treatment group was treated with ALA-PDT combined with portulacae mixture， while the control group was treated with ALA-PDT and portulacae mixture respectively. Specimens of the lesions before treatment and after 2， 4， and 8 weeks of treatment were collected， and the content of HPV DNA was detected by PCR. Results The condyloma acuminatum virus content in ALA-PDT combined with portulacae mixture treatment group and ALA-PDT control group after 2 weeks of treatment were significantly reduced， there was no statistically significant difference between the two groups （P>0.05）. There was no significant decrease in the condyloma acuminatum virus content in the portulacae  mixture group after 2 weeks of treatment. There was a statistically significant difference between the ALA-PDT combined with portulacae mixture treatment group， the ALA-PDT control group and XianCaoSu mixture group（P<0.05）. After 8 weeks of treatment， 53 patients in the combined treatment group had HPV virus content negative， 33 patients in the ALA-PDT control group and 18 patients the portulacae mixture control group and had HPV virus negative. There was a statistically significant difference between the combined treatment group， the ALA-PDT control group and Tangji control group（P<0.05）. There was a statistically significant difference between the ALA-PDT control group and Tangji control group（P<0.05）. After using different methods to treat the three groups of patients， the local HPV virus content was significantly lower than before treatment. After treatment by three different methods， HPV virus local content was significantly lower than that before treatment. Conclusion ALA-PDT combined with portulacae mixture is more effective than ALA-PDT and Portulacae mixture alone in treating condyloma acuminatum， and can significantly reduce the content of HPV virus DNA.

[Key words] ALA-PDT; Portulacae mixture; Condyloma acuminatum; PCR; HPV;DNA

尖锐湿疣（Condyloma Acuminatun， CA）是一种十分常见的性疾病，近年来，尖锐湿疣的发病率逐年攀升，在性传播疾病中其发病率居于第2 位[1]。传统的治疗尖锐湿疣的方法主要有外用药物（三氯乙酸和咪喹莫特）、手术治疗（冷冻、二氧化碳激光、手术切除、包皮切除）等，但不良反应较大，复发率高。人乳头瘤病毒 （humanpapllomaciras， HPV）潜伏感染和亚临床感染继续存在，是CA复发的主要因素。5-氨基乙酰丙酸光动力疗法（aminolevulinic acid photodynamic therapy，ALA-PDT）是一種外用光敏剂后联合635 nm红光照射，选择性地破坏增生活跃或异常增生的病变组织的治疗方法。国内外相关研究证实，ALA-PDT在清除HPV潜伏感染、亚临床感染及降低复发率等方面有明显效果[2]。然而，应用光动力治疗费用较高，一些患者难以承担多次治疗的费用。为了减轻患者的经济压力，使用光动力联合苋草苏合剂口服治疗尖锐湿疣，探讨在不同光动力治疗次数联合苋草苏合剂口服治疗尖锐湿疣的复发率、HPV转阴率，从而探究治疗尖锐湿疣的新型方案， 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年6～12月就诊于聊城市人民医院皮肤性病科、妇科及肛肠科的经过5%醋酸白试验证实的尖锐湿疣患者120例为研究对象。符合标准的尖锐湿疣患者随机分为ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组、ALA-PDT对照组和苋草苏合剂对照组。其中ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组54例，男 23 例，女 31例;年龄 20～58 岁，平均（34.25±4.87）岁;病程（4.16±1.27）个月;ALA-PDT对照组36例，男 19 例，女 17例;年龄 23～56岁，平均（32.24±2.18）岁;病程（5.16±2.38）个月。苋草苏合剂对照组30例，男 16例，女 14例;年龄17～49岁，平均（31.62±2.21）岁;病程（2.16±1.19）个月。三组患者皮损累及阴茎、包皮、龟头、肛周、大小阴唇和阴道口等部位，其性别、年龄、病程、皮损部位差异无统计学意义（P>0.05）。所有程序均由聊城市人民医院伦理委员会批准，所有患者均签署了书面知情同意书。

1.2 纳入标准

位于外生殖器及肛周的呈灰白或粉红色的乳头状、菜花状疣体;醋酸白试验结果呈阳性;HPV分型检测结果呈阳性。

1.3 排除标准

患有其他性传播疾病、自身免疫性疾病或其他严重慢性全身性疾病;过去3个月内使用过皮质类固醇和免疫抑制剂，过去2周内使用抗病毒药物;怀孕和哺乳期;皮肤光过敏患者，卟啉病患者，对局部用艾拉溶液中任一成分过敏者;疣体位于体腔内的患者。

1.4 方法

1.4.1 材料  盐酸氨基酮戊酸（上海复旦张江生物医药股份有限公司，国药准字H20070027，规格：118 mg）;苋草苏合剂（山东省聊城市人民医院，国药准字Z1608 0071，规格：240 mL）。

1.4.2 器材  光动力治疗仪（武汉亚格光电技术有限公司生产，型号LED-IB，功率20～100 mW/cm2）。

1.4.3 治疗方法  ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组用液氮逐一冷冻疣体，进行2次冻融循环。每周治疗1次。一般冷冻2～4 次， 即可观察到皮肤病变的消退;之后采用光动力治疗，首先用生理盐水将盐酸氨酮戊酸散配制成20%浓度的溶液，根据皮损的大小及部位，选取适当大小的无菌脱脂棉片，将ALA溶液均匀地涂抹于无菌脱脂棉片上，覆盖于原有疣体及其相邻的 1 cm 半径的正常皮肤上，用保鲜膜封包，4 h后使用635 nm的半导体激光照射，能量密度100 J/cm2，照射时间20 min /光斑，距离为20 cm，每周治疗1次[3]。苋草苏合剂口服，一次60 mL，一日2次。ALA-PDT对照组仅予以液氮冷冻及ALA-PDT治疗。苋草苏合剂对照组仅予以液氮冷冻及苋草苏合剂口服。

1.5 检测方法

使用PE2400PCR仪及DA-620型微量荧光检测仪（美国Perkin Elemer公司），检测试剂为人乳头瘤病毒6/11型和16/18型核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒（中山医科大学达安中心）。PCR检测：根据制造商的说明，使用人乳头瘤病毒基因分型试剂盒，从样品中提取DNA。PCR扩增在总反应体积为20 μL的条件下进行，其中添加了2 μL样品DNA。在每次PCR运行中，均包括2 μL阳性对照（6/11型和16/18型4种HPV基因的质粒）和阴性对照（空白水）。所有反应均在50℃下预孵育5 min，然后在95℃下初始变性10 min，然后在95℃下进行45个循环10 s，在58 ℃下进行40 s。对HPV病毒载量进行定性、定量分析。

1.6 观察指标

各组在经过2周、4周、8周治疗后的治愈数及其HPV DNA载量。

1.7 治愈标准

达到临床治愈，即经过治疗后疣体消失[4]。HPV DNA载量≤1.0×103 copies/mL为阴性，说明HPV DNA复制被抑制;>1.0×103 copies/mL为阳性，说明HPV DNA复制没有被抑制[5]。

1.8 统计学方法

采用SPSS 25.0统计软件，计量资料采用（x±s）表示，多组比较采用方差分析;计数资料采用[n（%）]表示，多组比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组患者治疗前后治愈例数比较

治疗8周后ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组有53例患者HPV病毒含量转阴，ALA-PDT对照组和苋草苏合剂对照组分别有33例和18例患者HPV病毒转阴，治疗组和ALA-PDT对照组和苋草苏合剂对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 三组患者治疗N周后HPV DNA载量的变化情况比较

各组治疗前后HPV DNA载量关系：治疗前三组患者局部HPV病毒含量差异无统计学意义（P>0.05）。ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组和ALA-PDT对照组患者治疗 2周后尖锐湿疣病毒含量均出现明显降低，两组比较差异无统计学意义（P>0.05），苋草苏合剂对照组患者治疗2周后尖锐湿疣病毒含量无明显降低，ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组和ALA-PDT对照组与苋草苏合剂对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。ALA-PDT对照组和苋草苏合剂对照组两组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。使用不同方法治疗三组患者后，其局部HPV DNA载量均较治疗前降低，治疗前后对比差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

尖锐湿疣是世界上最常见的性传播疾病，其发病与人乳头瘤病毒感染密切相关[6]。迄今已经发现并测序了 200 多种人乳头瘤病毒，其中约90%与HPV6型、11型相关，HPV16、18则是常见的高危型。2016 年全国 105个国家级性病监测点报告显示尖锐湿疣发病率大约为 24.65/10万[7]。尖锐湿疣治疗后的复发率较高，其复发原因包括但不限于 HPV潜伏感染和亚临床感染，与产生疣体的 HPV分型[8]、HPV免疫逃逸、真皮血管异常增生、干扰细胞凋亡途径、精神心理因素、不卫生性生活等相关[9]。2017年尖锐湿疣治疗专家共识指出，目前没有确切的证据表明任何一种治疗方案优于其他方案，要选择个体化治疗方案。因此，寻找新的个体化联合治疗方案，对于清除HPV的潜伏感染和亚临床感染，降低尖锐湿疣的复发率具有重要意义。

近十余年来，PCR检测技术日益广泛地应用于 HPV感染的诊断[10]，其检测结果敏感性、可靠性均较高。通过与传统一般检测方法相比较发现，HPV PCR检测的敏感性、特异性和一致性率（准确性）分别为98.4%，99.6%和99.6%，其各项指标均明显优于一般检测方法，特别是在潜伏感染以及亚临床感染中。目前，Southern印迹、斑点印迹以及荧光定量PCR等是PCR检测 HPV DNA的主要方法。荧光定量 PCR方法已广泛应用于临床，得到了临床医师的一致认可。包括基因型测定和病毒载量测量在内的 HPV DNA 检测可以作为PDT疗效的指标。HPV DNA 病毒载量的动态改变能够反映尖锐湿疣的治疗进展并预测潜伏感染和亚临床感染是否被清除，基因型测定能够识别HPV高危亚型感染。阴性结果可以同时排除亚临床或潜伏感染的可能性[11]。本研究采用该技术主要检测常见的HPV6、11、16和18亞型感染。

近年来应用光动力治疗尖锐湿疣的报道逐渐增多。5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）本身并无光敏性，而是一种体内血红素合成的前体物质。局部用药后，5-ALA被皮肤和黏膜吸收，通过血红素生物合成途径代谢为具有光敏活性的原卟啉Ⅸ（ Pp IX），诱导疣体细胞（增生活跃组织）内选择性地富集 Pp IX 后，用635 nm波长的红光辐照，发生光动力学反应，并产生单态氧等活性氧物质，杀伤异常增殖细胞[12]，从而达到治疗目的，对于潜伏感染和亚临床感染同样有较好疗效。由于仅被 HPV 感染的增生活跃的细胞才会吸收 ALA，而正常皮肤黏膜无吸收或者吸收很少，几乎不会损伤正常的皮肤黏膜组织，可以避免反复物理治疗对上皮细胞的不良刺激，且没有严重的局部不良反应。此外，原卟啉Ⅸ可以在 24 h内从体内清除，不会长时间累积在组织中，也不会在多次治疗后增加光毒性反应。所以该治疗方法特异性强，而且患者治疗依从性和耐受性高，具有可重复治疗、选择性高及毒副作用小等优点[13]。

苋草苏合剂主要由大青叶、马齿苋、莪术、土茯苓、苏木、三棱等中药成分组成，大量的药理研究也表明，马齿苋具有抗炎、镇痛、抑菌、抗肿瘤的作用，并且通过促进人淋巴细胞转化，提高人体 NK细胞活性，增强机体正常的免疫功能，改善机体异常的免疫功能[14]。大青叶中含有多种生物碱，其中喹唑酮是抗病毒有效成分，此外大青叶还具有抗炎、解热、增强免疫等多种作用[15]。莪术的主要成分为姜黄素，能够直接或间接地影响核因子-κB（NF-κB）信号传导通路。目前认为，NF-κB参与机体内大多数宿主的免疫、炎症反应以及调控抗凋亡、肿瘤的形成和转化[16]。三棱成分较为复杂，能够发挥抗炎、抑制血管形成、抗肿瘤等作用，与莪术配伍可增强上述作用[17]。苏木的主要成分有原苏木素类、巴西苏木素类、查尔酮类，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护血管等作用[18]。诸药和合，可使药物力透肌肤，直达病灶，共同发挥解毒散结、破血祛瘀、行气止痛、化赘蚀疣的功效。因此，能够抑制HPV DNA的复制，控制潜伏感染、亚临床感染，从而降低尖锐湿疣的复发率。

本研究中，于治疗前后应用PCR检测技术检测尖锐湿疣患者局部皮损的HPV病毒载量，最终结果显示：ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组、ALA-PDT对照组和苋草苏合剂对照组在治疗前HPV病毒载量比较，差异无统计学意义（P>0.05），在经过8周治疗之后，ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组中的53例患者HPV病毒载量转阴，ALA-PDT对照组和苋草苏合剂对照组分别有33例和18例患者HPV病毒含量转阴，ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组和ALA-PDT对照组和苋草苏合剂对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。ALA-PDT对照组和苋草苏合剂对照组两组相比较差异有统计学意义（P<0.05），ALA-PDT联合苋草苏合剂治疗组、ALA-PDT对照组和苋草苏合剂对照组经过治疗后，其局部皮损的HPV病毒载量均较治疗之前明显降低，治疗前后对比均具有统计学意义。说明ALA-PDT联合苋草苏合剂较单纯用ALA-PDT和单纯用苋草苏合剂能更有效地治疗尖锐湿疣，并能明显降低HPV病毒DNA的含量。

[参考文献]

[1] 赵辩.临床皮肤病学[M].第3版.南京：江苏科学技术出版，2010：112-119.

[2] Wang J，Li S，Li Z，et al.Human papillomavirus DNA detection-guided ALA-photodynamic therapy for anogenital condyloma acuminata：A report of two cases[J].Photodiagnosis Photodyn Ther，2019，25：460-462.

[3] Van Doorslaer K，Tan Q，Xirasagar S，et al. The papillomavirus episteme：A central resource for papillomavirus sequence data and analysis[J]. Nucleic Acids Res，2013， 41（Database Issue）：D571-D578.

[4] 陆小年，徐金华.尖锐湿疣治疗专家共识（2017）[J].临床皮肤科杂志，2018，2：125-127.

[5] 金丽华，胡德新，楼航芳.柴胡注射液外用治疗女性外阴尖锐湿疣的临床疗效及对病变组织HPV-DNA载量影响研究[J].健康研究，2014，2：149-151，154.

[6] Park IU，Introcaso C，Dunne EF. Human papillomavirus and genital warts：A review of the evidence for the 2015 centers for disease control and prevention sexually transmitted diseases treatment guidelines[J]. Clinical Infectious Diseases，2015，61（suppl 8）：S849-S855.

[7] 岳晓丽，龚向东，李婧，等.2008-2016 年中国性病监测点尖锐湿疣流行特征分析[J]. 中华皮肤科杂志，2017， 50（5）：321-325.

[8] 黄庚史，刘广仁，韩永智，等.高危 HPV 亚型对尖锐湿疣患者HPV 持续感染的影响[J].中国皮肤性病学杂志，2017，31（10）：1100-1101，1104.

[9] 徐金华.尖锐湿疣的复发与防治[J].中华皮肤科杂志，2015，48（5）：297-300.

[10] 高宇，马新华，王荣跃.CA患者皮损中HPV的检测分型及HPV6bL1变异分析[J].中华皮肤科杂志，2010，43（5）：336-338.

[11] Valari O，Koliopoulos G，Karakitsos P，et al. Human papilloma virus DNA and mRNA  positivity of the anal canal in women with lower genital tract HPV lesions：  Predictors and clinical implications[J]. GynecologicOncology，2011，122（3）：505-508.

[12] Shi H，Zhang X，Ma C，et al. Clinical analysis of five methods used to treat condylomata acuminata[J]. Dermatology，2013，227（4）：338-345.

[13] 方文宇，吳昊，王茜，等.尖锐湿疣的治疗现状及进展[J].北京医学，2016，38（12）：1315-1317.

[14] 王天宁，刘玉婷，肖凤琴，等. 马齿苋化学成分及药理活性的现代研究整理[J]. 中国实验方剂学杂志，2018， 6：224-234.

[15] 赵晓娟，李琳，刘雄，等. 大青叶的本草学研究、化学成分及药理作用研究概况[J]. 甘肃中医学院学报，2011， 5：61-64.

[16] 赵志梅，张立杰，夏天，等. 莪术主要单体成分抗炎、抗肿瘤作用研究进展[J]. 药物评价研究，2017，1：119-124.

[17] 冯娅茹，张文婷，李二文，等. 三棱化学成分及药理作用研究进展[J]. 中草药，2017，22：4804-4818.

[18] 皇甫海全，于海睿，孙静. 苏木化学成分及药理作用研究进展[J]. 湖北中医药大学学报，2018，6：109-113.

（收稿日期：2020-02-19）