乳腺癌化疗耐药与MTDH过表达的关系及机制分析

张玲芳，方晓露，高媛媛，吕怀盛

乳腺癌是女性癌症死亡的主要原因之一[1-2]。目前乳腺癌的治疗方法主要包括手术、放化疗、内分泌以及靶向治疗，其中化疗是治疗乳腺癌的主要方式之一，对于术后和晚期乳腺癌患者常用含紫杉类和(或)蒽环类化疗方案进行治疗，然而化疗耐药易使乳腺癌复发和转移[3]。目前认为P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)表达升高与多药耐药(multidrug resistance, MDR)的产生密切相关[4]。异黏蛋白(metadherin, MTDH)属于癌基因蛋白，有研究表明其过表达与乳腺癌的发生及化疗耐药均密切相关[5]，其具体机制有待进一步分析。本文着重探讨乳腺癌组织中MTDH与P-gp表达的相关性及MTDH过表达诱导乳腺癌化疗耐药的可能机制，为病理与临床医师提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1组织学标本 收集2016年1月～2017年12月宁夏医科大学总医院肿瘤医院病理科存档的89例乳腺非特殊型浸润性癌手术切除标本(其中4例复发、转移)，患者均为女性，中位年龄52岁。所有病例术前均未行任何放、化疗等抗肿瘤治疗，患者术后均接受至少2个周期的常规化疗。

1.1.2细胞及病毒 人乳腺癌细胞株MCF-7购自上海吉凯公司，LV-MTDH慢病毒(25853-2)和阴性对照病毒CON238由上海吉凯公司设计合成。

1.1.3主要试剂 细胞培养用胎牛血清购自BI公司，DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司。CCK-8试剂盒购自上海东仁公司，Western blot试剂盒购自江苏凯基公司。免疫组化用抗体MTDH(ZA-0346)和P-gp(ZM-0189 C494)均购自北京中杉金桥公司，Western blot实验用抗体MTDH(Ab-BF0508)、P-gp(Ab-AF5185)、β-catenin(Ab-AF6266)、p-AKT(Ser473)(AF0016)、AKT(AF6261)、p-GSK-3β(Ser9)(Ab-AF2016)、GSK-3β(Ab-AF5016)和GAPDH(AF7021)均购自Affinity公司。药物紫杉醇(HY-B0015)和阿霉素(HY-15142)均购自MCE公司。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 所有组织均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，行HE和免疫组化SP法染色。一抗为兔抗人MTDH多克隆抗体工作液和鼠抗人P-gp单克隆抗体工作液，以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性标本作阳性对照。MTDH和P-gp以肿瘤细胞胞质或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性，根据细胞着色强度及阳性细胞百分比进行评估。MTDH按细胞着色强度计分：无阳性着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞百分率计分：无阳性肿瘤细胞为0分、1%～20%为1分、21%～50%为2分、51%～70%为3分、>70%为4分；将上述两项得分结果相乘：≥4为高表达，≤3为低表达。P-gp按细胞着色强度计分：无阳性着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞百分率计分：无阳性肿瘤细胞为0分，≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；将上述两项得分结果相加，0～1分为(-)，2～3分为(±)，4～5分为(+)，6～7分为()，其中(-)和(±)判为低表达，(+)和()判为高表达。

1.2.2细胞培养与慢病毒感染 MCF-7乳腺癌细胞株用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基置入37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中常规传代、培养。取生长状态良好的对数生长期MCF-7常规消化，调整细胞数为每毫升5×104个细胞，接种于6孔板，每孔2 mL细胞悬液。设置3个组：空白对照组、阴性对照组和MTDH过表达组。待细胞贴壁后，空白对照组加入1 mL完全培养基，阴性对照组和MTDH过表达组以MOI=50加入相对应的慢病毒液感染24 h。感染后72 h加入1 μg/mL嘌呤霉素对阴性对照组和MTDH过表达组细胞进行稳定株筛选，同时收集各组细胞进行Western blot检测，结果稳定后将鉴定结果正常的细胞冻存，进行后续实验。

1.2.3CCK-8实验 将培养的阴性对照组和MTDH过表达组细胞按每毫升10×104个细胞的密度接种于96孔板，接种体积每孔100 μL。待细胞贴壁后，向96孔板中加入浓度为1 μmol/mL的紫杉醇或1 μmol/mL阿霉素处理细胞48 h，取出96孔板小心吸弃96孔板中含药物的培养基，每孔加入100 μL完全培养基和10 μL的CCK-8液，放入细胞培养箱孵育2 h后用酶标仪测定450 nm处吸光度，计算药物的抑制率[抑制率=(对照孔-实验孔)/(对照孔-空白孔)]。

1.2.4Western blot法 收集空白对照组、阴性对照组和MTDH过表达组细胞，提取各组细胞总蛋白，利用BCA法测定蛋白浓度，制备8%SDS-PAGE凝胶，每泳道上样50 μg/10 μL对蛋白样品进行电泳分离，分离后将蛋白转至PVDF膜，10%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，经ECL发光法显色后，用Image J软件进行分析，以目的条带灰度值与对应泳道GAPDH灰度值的比值表示各样本蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，两独立样本间均数比较采用t检验，多个样本间均数比较采用单因素方差分析，两个样本率间比较采用四格表资料的χ2检验，多个样本率间比较采用行×列表资料的χ2检验，采用Spearman秩相关对两等级数据变量进行分析。每个实验至少重复3次，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌及癌旁组织中MTDH的表达MTDH蛋白阳性呈棕色或棕黄色颗粒，主要定位于肿瘤细胞胞质或胞膜(图1)。MTDH在乳腺癌和癌旁组织中的高表达率分别为97.8%和25.8%，乳腺癌中MTDH高表达率明显高于癌旁组织(P<0.01，表1)。

ABCD

表1 乳腺癌和癌旁组织中MTDH的表达[n(%)]

2.2 乳腺癌中MTDH和P-gp蛋白表达的相关性MTDH和P-gp蛋白均高表达59例，均低表达0例，仅MTDH高表达28例，仅P-gp高表达2例。相关分析结果显示，MTDH表达水平随P-gp表达的增高而增高，两者在乳腺癌中的表达呈显著正相关(rs=0.568，P<0.01，表2)。

表2 乳腺癌中MTDH和P-gp蛋白表达的相关性

2.3 过表达MTDH的MCF-7乳腺癌细胞对紫衫醇和阿霉素耐受性的影响经1 μmol/mL紫杉醇或1 μmol/mL阿霉素分别处理MCF-7乳腺癌细胞48 h后，与阴性对照组相比，MTDH过表达组对紫衫醇和阿霉素的敏感性明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。表明MTDH过表达可明显提高MCF-7乳腺癌细胞对紫衫醇和阿霉素的耐受性。

图2 CCK-8实验检测过表达MTDH的MCF-7乳腺癌细胞对紫杉醇和阿霉素敏感性的影响

2.4 MTDH过表达对MCF-7乳腺癌细胞P-gp表达的影响MTDH过表达组中P-gp蛋白表达水平明显升高，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05，图3)。表明在MCF-7乳腺癌细胞中MTDH过表达可引起耐药蛋白P-gp过表达。

2.5 MTDH过表达对MCF-7乳腺癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响MTDH过表达组中β-catenin蛋白水平升高，p-AKT(Ser473)及p-GSK-3β(Ser9)的磷酸化水平升高，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05，图4)。表明在MCF-7乳腺癌细胞中MTDH过表达激活Wnt/β-catenin信号通路。

图3 Western blot法检测MTDH过表达对MCF-7乳腺癌细胞P-gp的影响

图4 Western blot法检测MTDH过表达对MCF-7乳腺癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

3 讨论

化疗耐药的产生是乳腺癌治疗过程中长期以来面临的难题，其影响乳腺癌患者的治疗效果，因此乳腺癌化疗耐药的机制研究一直是众多学者的研究热点[6]。MTDH(又名AEG-1、LYRIC或3D3)是近年来发现的癌基因，人类MTDH基因定位于8q22染色体上，该区域存在与许多癌症发生相关的扩增和突变，且与不良预后有关[7]。MTDH参与PI3K/AKT、NF-κB和MAPK等信号通路，促进肿瘤的异常增殖、侵袭、血管生成、远处转移和化疗耐药等[8]。MTDH在大多数正常人乳腺组织中表达水平较低甚至缺乏，但其在乳腺癌中的表达水平则增高[9]。本组实验结果显示，MDTH在乳腺癌组织和对应癌旁组织中均表达，在乳腺癌和癌旁组织中的高表达率分别为97.8%和25.8%，癌组织中MTDH的高表达率明显高于癌旁组织，与文献报道MTDH在乳腺癌中的高表达结果一致[9]，提示MTDH高表达与乳腺癌的发生、发展密切相关。有研究显示，乳腺癌中MTDH过表达与TNM分期、远处转移和低生存率有关[9]。本实验收集乳腺癌病理类型均为浸润性非特殊癌，病理类型太过单一，致使MTDH高表达率过高无法统计MTDH高表达与乳腺癌临床病理特征的关系。

MDR是目前肿瘤细胞免受化疗药物攻击的重要细胞防御机制，P-gp是常见的MDR蛋白，其过表达是肿瘤产生耐药的重要原因之一[4]。P-gp具有膜的药泵作用，既可减少药物流入，也能主动将进入肿瘤细胞内的化疗药物泵出，使肿瘤细胞内抗癌药物蓄积减少，从而产生耐药性[4]，其转运的药物通常为大分子量的亲脂性化合物，包括治疗乳腺癌常用的化疗药紫杉醇和阿霉素。有研究显示，在肝癌中MTDH可以通过增加P-gp表达增加阿霉素的外排，减少阿霉素在细胞内的积累，从而促进阿霉素的耐药[10]。在乳腺癌中，有研究者采用shRNA干扰技术沉默了乳腺癌细胞MCF-7/ADM中MTDH基因，结果表明沉默MTDH基因可以通过促进乳腺癌细胞MCF-7/ADM凋亡和降低P-gp蛋白表达，逆转乳腺癌细胞MCF-7/ADM对阿霉素的耐药性[11]。为进一步探讨MTDH过表达引起的乳腺癌化疗耐药与耐药蛋白P-gp的关系，本实验检测了MTDH和P-gp蛋白在89例乳腺癌组织中表达的相关性，结果显示MTDH与P-gp的表达呈正相关，采用慢病毒感染的方法在乳腺癌细胞MCF-7中过表达MTDH，引起了P-gp蛋白表达增高，并且提高了乳腺癌细胞对紫杉醇和阿霉素的耐受性，提示MTDH过表达可能是通过增加P-gp蛋白表达引起乳腺癌细胞对紫杉醇和阿霉素的耐药性。

有文献报道PI3K/AKT和NF-κB信号通路与MTDH引起的乳腺癌化疗耐药有关[10，12]，但与Wnt/β-catenin信号通路的相关性少有报道。Wnt/β-catenin信号通路是调节细胞增殖、迁移、分化的一个重要途径，是乳腺癌发生、发展的重要调控机制[13]。2007年Woodward等[14]报道原代小鼠乳腺上皮祖细胞对辐射具有抵抗性，并且这种抗性是由β-catenin信号通路介导，提示Wnt/β-catenin信号通路在乳腺癌放疗抵抗中发挥一定的作用。本实验探索了MTDH过表达引起的乳腺癌化疗耐药与Wnt/β-catenin信号通路的关系，结果显示MTDH过表达使β-catenin蛋白表达增加，p-AKT(Ser473)和p-GSK-3β(Ser9)磷酸化水平增高，提示MTDH过表达引起的乳腺癌化疗耐药可能由Wnt/β-catenin信号通路来介导，通过MTDH/AKT/GSK-3β信号轴，MTDH控制β-catenin的磷酸化水平，使得P-gp蛋白表达增高，从而引起乳腺癌细胞对紫杉醇和阿霉素的耐药性。

综上所述，MTDH和P-gp在乳腺癌中均高表达，其与乳腺癌的化疗耐药密切相关。在MCF-7乳腺癌细胞中过表达MTDH，可以引起P-gp蛋白表达升高及Wnt/β-catenin信号通路的活化，从而使得乳腺癌细胞对紫杉醇和阿霉素的耐受性增加，这可能是MTDH过表达导致乳腺癌化疗耐药的机制之一，但仍需更进一步分析。