豌豆低聚肽中具有发挥功能活性潜力的结构研究

王雨晴，毕园，张瑞雪，方磊，周明，陈亮，谷瑞增

(中国食品发酵工业研究院有限公司，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心, 北京，100015)

豌豆是我国重要的农作物之一，具有高淀粉、高蛋白、低脂肪等特点，其蛋白质含量为23%～25%，氨基酸组成比较平衡，具有谷类食物中较为缺乏的赖氨酸，与FAO/WHO推荐模式较为接近，是一种优良的植物蛋白资源[1-2]。目前我国主要利用豌豆中的淀粉制作粉丝，而对其副产物豌豆蛋白尚未充分开发和利用[3-4]，因此，对这部分优质植物蛋白资源作为副产物进行加工利用，提高产品附加值将是未来研究的重点和热点。

目前，研究人员通过酶解豌豆蛋白制备的豌豆低聚肽具有抗氧化、降血压、免疫调节等功能活性。秦修远等[5]考察了以碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶解得到的豌豆低聚肽自由基清除能力和还原能力，结果表明豌豆低聚肽具有较好的抗氧化活性。张秋萍等[3]利用中性蛋白酶和胰蛋白酶分步酶解豌豆蛋白得到了具有抗氧化活性的豌豆低聚肽，并经凝胶色谱和反相色谱分离纯化得到一条与谷胱甘肽(glutathione,GSH)抗氧化活性相似的八肽成分。刁静静等[4]将豌豆蛋白用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶水解得到豌豆蛋白水解物并测定其抗氧化活性，结果表明抗氧化活性随水解时间的延长而提高。NIEHUES 等[6]使用胰蛋白酶水解豌豆蛋白，结果表明相对分子质量 <10 kDa 的豌豆抗菌肽可通过降低幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori) 对胃上皮细胞的黏附性来降低婴幼儿对幽门螺旋杆菌的感染率。朱玲[7]分别选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶对豌豆蛋白进行酶解，得到血管紧张素转化酶抑制活性最强的肽段多由 2～4 个氨基酸组成。NDIAYE 等[8]使用嗜热菌蛋白酶对豌豆蛋白进行水解，超滤后得到相对分子质量约为 3 kDa 的豌豆多肽具有抗炎和免疫调节的作用。虽然豌豆低聚肽具有一定功能活性，但豌豆低聚肽是由不同结构肽段组成的混合物，其发挥功能活性作用的结构尚不明确。

低聚肽的制备多采用耐热菌产生的蛋白酶对原料进行酶解，比如碱性蛋白酶，中性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶等，这些蛋白酶多具有很强的内切酶活性，但其外切酶活性相对较弱[9]。CHEN等[10]对玉米蛋白来源的25种低聚肽进行了抗外切酶消化研究，结果表明N端为焦谷氨酸结构特点的二肽和三肽可以抵抗外切酶消化。焦谷氨酸的内酰胺环结构使这些肽对消化蛋白酶更具抵抗力，从而可以增强其天然形式的肽吸收。焦谷氨酰胺(pyroglutamamide,pGlu)肽是由肽的N末端位置的谷氨酰胺或谷氨酸残基通过脱酰胺或脱水内环化形成的。谷氨酰胺和谷氨酸在高温高压下易发生环化作用，从而形成焦谷氨酸[11-12]。豌豆蛋白中存在较高含量的谷氨酸和谷氨酰胺，在酶解过程中，暴露在N端的谷氨酸和谷氨酰胺残基可能形成焦谷氨酸残基。

本文研究豌豆低聚肽中具有焦谷氨酸残基的肽段结构以及含有焦谷氨酸残基肽的抗消化能力，旨在为低聚肽的构效关系研究提供一些思路，为豌豆低聚肽的产品开发和市场应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

相对分子质量标准品：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(相对分子质量189)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(相对分子质量451)、杆菌酶(相对分子质量1 450)、细胞色素C (相对分子质量12 500，美国Sigma公司)。

低聚肽标准品：焦谷氨酰赖氨酸二肽(pyoglutamyl-lysine,pEK)、焦谷氨酰谷氨酸二肽(pyoglutamyl-glutamate,pEE)、焦谷氨酰精氨酸二肽(pyoglutamy-arginine,pER)(纯度≥99%)，苏州强耀生物科技有限公司；乙腈(色谱纯)，德国Merck公司；甲酸(色谱纯)，迪马科技；超纯水(18.2 MΩ·cm)由Milli-Q纯水系统制备。

食品级碱性蛋白酶Alcalase 2.4 L、复合蛋白酶Protamex 1.6，诺维信公司；羧肽酶A、亮氨酸氨基肽酶，Sigma公司。

1.2 仪器与设备

Nexera X2超高效液相色谱仪、LCMS-8060三重四极杆质谱仪联用系统，日本岛津公司。XS205DU分析天平，美国Mettler Toledo公司；QL-901涡旋混合仪，其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 豌豆低聚肽的制备

将400 g豌豆蛋白加入5 L去离子水中，搅拌均匀。料液在50 ℃、pH 8.0条件下经碱性蛋白酶酶解3 h(酶与底物质量比1∶100)后，继续在50 ℃条件下利用复合蛋白酶酶解2 h(酶与底物质量比为比1∶50)。料液于100 ℃水浴10 min灭酶，然后离心(3 000 r/min，15 min)取上清液。利用1 000 Da的超滤膜将上清液超滤，得到相对分子质量低于1 000 Da的豌豆低聚肽溶液，溶液经浓缩、喷雾干燥后得到豌豆低聚肽粉末。

1.3.2 蛋白质及肽含量测定

总蛋白含量采用GB 5009.5—2010规定的方法测定[13]，蛋白质换算系数为6.25；参考GB/T 22729—2008测定酸溶蛋白和低聚肽含量[14]。

1.3.3 相对分子质量分布

参照GB/T 22729—2008中6.3的方法，采用高效凝胶过滤色谱法进行测定[14]。

1.3.4 氨基酸组成

参考GB 5009.124—2016第一法 氨基酸自动仪 进行分析[15]。色氨酸采用碱水解法，用6 mol/L NaOH溶液水解，其余均以6 mol/L HCl溶液水解测定。

1.3.5 外肽酶消化

参考CHEN等用羧肽酶A、亮氨酸氨基肽酶2种外切酶消化[10]。将200 mg豌豆肽溶于100 mL的50 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中。将1 mL该溶液与6单位的羧肽酶A和2单位的亮氨酸氨基肽酶混合，并在37 ℃水浴中温育8 h。通过超滤去除外切酶终止反应。

1.3.6 低聚肽结构的测定

低聚肽结构的测定利用超快速液相色谱串联三重四极杆质谱方法测定。

样品处理：用纯水将样品稀释100倍，离心处理后(10 000 r/min离心10 min)取上清液，用孔径为0.22 μm尼龙过滤膜过滤后，制得待测样品。

液相色谱条件：色谱柱Inertsil ODS-3(2.1 mm×250 mm,5 μm)；流动相A为体积分数0.1% 甲酸水溶液，B为体积分数0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序0～15 min，B 0%～50%；15～20 min，B 50%～100%；20～25 min，B 100%；25.1～35 min，B 0%；流速0.2 mL/min；进样体积10 μL；柱温40 ℃。质谱条件：离子化模式ESI, 正离子模式；离子喷雾电压+4.5 kV；雾化气流速N23.0 L/min；加热气流速N210 L/min；干燥气流速N210 L/min；DL温度250 ℃；加热模块温度400 ℃；离子源温度300 ℃；扫描模式 多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)；驻留时间100 ms；延迟时间3 ms；MRM参数见表1。

表1 化合物的MRM优化参数Table 1 The multiple reaction monitoring conditions of the analytes

2 结果与分析

2.1 豌豆低聚肽的蛋白质、低聚肽含量及相对分子质量分布

分析表明，豌豆低聚肽蛋白含量高，干基蛋白含量为86.27%，且多以低聚肽的形式存在，干基肽含量为81.82%。豌豆低聚肽的相对分子质量分布色谱如图1所示，峰1、峰2、峰3、峰4分别为相对分子质量12 500、1 450、451和189 Da的标准品色谱峰，黄色谱图代表豌豆低聚肽样品，相对分子质量分布结果见表2。

图1 豌豆低聚肽相对分子质量分布色谱图Fig.1 Chromatograph of relative molecular weight distribution

表2 豌豆低聚肽相对分子质量分布Table 2 Relative molecular weight distribution of pea oligopeptides

豌豆低聚肽是以豌豆蛋白为原料经预处理、酶解、分离等工艺制得，为低聚肽的混合物，结果显示，低聚肽相对分子质量主要集中在140～1000 Da，占总比例的83.61%。相对分子质量<1 000 Da的蛋白水解物，由于含有小分子肽，更容易被人体直接吸收，发挥生理功能[16-17]。因此豌豆低聚肽中高比例小分子蛋白水解物可能被人体直接吸收和利用。

2.2 豌豆低聚肽的氨基酸组成

由表3可知，组成豌豆低聚肽的氨基酸总量为82.73%，必需氨基酸含量为27.61%，占豌豆低聚肽氨基酸总量的33.37%。所有氨基酸中谷氨酸(谷氨酰胺)含量最高为16.61%，含量最高的必需氨基酸是赖氨酸为6.77%，含硫氨基酸含量较低，这一结果与孙冬阳等[18]的报道一致。谷氨酸(谷氨酰胺)在豌豆低聚肽中含量最高，与图2中豌豆球蛋白序列中谷氨酸(E)和谷氨酰胺(Q)所占比例一致。谷氨酸和谷氨酰胺是焦谷氨酸前体，所以豌豆蛋白在酶解过程中可能会产生焦谷氨酸肽。

表3 豌豆低聚肽的氨基酸组成及含量Table 3 Amino acid profile of pea oligopeptides

图2 Uniprot 数据库中豌豆球蛋白的序列Fig.2 Sequence of pea vicilin from Uniprot database注：谷氨酸(E)和谷氨酰胺(Q)分别以绿色和红色字体表示；产生pEK、pEE和pER的前体EK、EE、ER和QK、QE、QR分别以不同颜色突出显示

2.3 豌豆低聚肽的序列结构及抗消化能力

经质谱鉴定得到，豌豆低聚肽中存在pEK、pEE和pER三条N端为焦谷氨酸残基的二肽结构，二级质谱图和定量色谱图如图3和图4所示，其中84为pGlu残基的特征产物离子。另外，经质谱扫描，豌豆低聚肽中不存在EK、EE、ER和QK、QE、QR结构，结果未显示。

图3 豌豆低聚肽中3条肽段的二级质谱图Fig.3 Secondary mass spectra of three peptide sequences in pea oligopeptides

图4 豌豆低聚肽中3条肽段的定量色谱图Fig.4 Quantitative chromatogram of three peptide sequences in pea oligopeptides

利用羧肽酶A、亮氨酸氨基肽酶验证鉴定出3条肽段序列结构的抗消化性，消化前后3条肽段的含量见表4。

表4 豌豆低聚肽中消化前后3条肽段的含量 单位：mg/100 gTable 4 Contents of three peptide sequences in pea oligopeptides before and after digestion

豌豆低聚肽中pEK、pEE和pER含量分别为201.85，75.30和110.84 mg/100 g， 经Uniprot蛋白数据库验证，豌豆蛋白中存在pEK、pEE和pEK的前体EK、EE、ER和QK、QE、QR，如图2突出显示，在酶解过程中，N端的谷氨酸或谷氨酰胺通过脱酰胺或脱水内环化转化为焦谷氨酰胺，这与CHEN等[10]报道的一致。经过氨基肽酶和羧肽酶消化后，pEK、pEE和pER含量均有所提高，可能因为在消化过程中豌豆低聚肽部分肽段转化为这3种结构。这3条肽段均为在豌豆低聚肽中首次发现。

研究报道焦谷氨酸肽具有生物活性，例如抗抑郁、肝保护、抗炎活性和免疫调节等[19-22]。YAMAMOTO等[19]研究表明，焦谷氨酰亮氨酸二肽(pyrogutamyl-leucine,pEL)和焦谷氨酰谷氨酰胺亮氨酸(pyroglutamyl-glutamine-leucine,pEQL)在小鼠的尾部悬浮液和强迫游泳试验中表现出抗抑郁活性。与未经修饰的肽Gln-Gln-Leu相比，较低剂量的pGlu-Gln-Leu显示出抗抑郁作用，从而证明内酰胺环在生物活性中的重要性。SATO等[20]研究表明，口服(pEL二肽)可以减轻D-半乳糖胺诱发的小鼠急性肝炎。HIRAI等[21]研究表明，pEL通过阻断RAW 264.7巨噬细胞中的核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)和有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)途径来抑制脂多糖诱导的炎症反应。这些功能作用可能与含有抵抗胃肠消化能力的焦谷氨酸残基有关。SATO等[20]从口服小麦低聚肽的大鼠血液中检测到pEL[20]。从摄入小麦低聚肽的大鼠静脉血中也发现了肽形式的焦谷氨酸[23]。焦谷氨酸内酰胺环的形成代替了极性酰胺基，增加pGlu肽的疏水性，使焦谷氨酸肽更有可能被生物利用。

豌豆肽中所含有的3条焦谷氨酸肽具有抗外切酶消化能力，在发挥生物活性中具有明显优势。

3 结论

豌豆低聚肽的干基蛋白和干基肽含量分别为86.27%和81.82%，含量较高。分子量分布结果显示，低聚肽主要集中在140～1 000 Da，占总比例的83.61%。组成豌豆低聚肽的必需氨基酸含量为27.61%，占豌豆低聚肽氨基酸总量的33.37%。所有氨基酸中谷氨酸含量最高为16.61%，是形成焦谷氨酸的前体氨基酸。

豌豆低聚肽中发现3条具有抗外切酶消化功能的肽段，pEK、pEE和pER，含量分别为201.85，75.30和110.84 mg/100 g，经过氨基肽酶和羧肽酶消化后，含量均有所提高，可能是因为豌豆低聚肽在消化过程中部分肽段转化为这3种结构，这3条肽段均为在豌豆低聚肽中首次发现。焦谷氨酸肽的功能作用可能与含有的焦谷氨酸残基抵抗胃肠消化能力有关。

豌豆作为良好的蛋白质来源，尚未得到很好的开发和利用。研究通过对豌豆低聚肽的营养成分及抗外切酶消化肽段的研究，为豌豆蛋白的开发提供了理论依据。