实时荧光核酸恒温扩增检测技术对痰标本中结核分枝杆菌的诊断价值*

柴国祥，李兴芳，韩斌孝，王磊，杨永红，章国平，牛晨霞

（1.兰州市肺科医院，甘肃 兰州 730046；2.甘肃省医学情报研究所，甘肃 兰州 730050；3.甘肃省妇幼保健院，甘肃 兰州 730050）

肺结核 （pulmonary tuberculosis，PTB） 是由结核分枝杆菌 （mycobacterium tuberculosis，MTB） 引起的经由呼吸道传播的传染病，目前仍然是全球危害最为严重的慢性传染病，尤其是对发展中国家。我国一直以来都是PTB的高负担国，2018年世界卫生组织发布的报告显示，中国结核病新发患者约为88.9万例[1]。因此建立快速准确检测结核病的方法尤为重要。传统的罗氏培养法是目前检验结核病的金标准，虽然有不同程度的改良，但是检验周期过长，操作复杂[2]。噬菌体扩增技术和液体培养技术，虽然都能够快速检测，但操作要求高，技术复杂，推广仍有困难[3-4]。随着分子生物学技术的发展，基于MTB DNA或RNA的快速检测技术越来越得到重视，先后出现了以传统PCR技术为基础的TB-DNA检测及以半巢式荧光定量PCR技术为基础的自动化核酸扩增检测技术 （Xpert MTB/RIF）。但是两者的缺陷也很明显，TB-DNA技术假阳性高，临床诊断不准确[5-6]；Xpert MTB/RIF 价格昂贵，不适用于基层医院推广[7]。

实时荧光核酸恒温扩增检测 （simultaneous amplification and testing，SAT） 技术具有以下几个特点：①专有的核酸恒温放大实时荧光检测体系；②更高的扩增效率 （30 min内扩增10亿倍），确保更高的检测敏感性；③活菌检测技术。由于RNA 在自然环境中快速降解，在死亡的病原体中几乎检测不到RNA，该方法有效地解决PCR技术检测MTB DNA时导致的假阳性问题[8]。

本研究采用SAT法对疑似结核病患者痰液进行检测，并与其他检测方法比较，评价SAT法对MTB的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月—2018年12月兰州市肺科医院收治的PTB患者和同期接受检查的无证据显示为PTB患者182例为研究对象。经临床确诊为活动性PTB 115例作为观察组。其中，男性63例，女性52例；男∶女=1.2∶1.0，平均年龄 （41.6±11.7） 岁。非活动性PTB 67例作为对照组。其中，男性42例，女性25例；男∶女=1.7∶1.0，平均年龄 （44.1±15.3） 岁。两组性别构成比、年龄比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者家属签署知情同意书。

1.2 仪器与设备

MTB 核酸检测试剂盒 （RNA 恒温扩增） （上海仁度生物技术有限公司），MTB rpoB基因和突变检测试剂盒 （实时荧光PCR法） （美国Cepheid公司），MTB核酸检测试剂盒 （PCR荧光探针法） （湖南圣湘生物科技有限公司），7300 Real-time PCR System （美国ABI公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 痰标本碱处理将收集的痰标本加入等体积的N-乙酰-L-半胱胺酸-氢氧化钠 （NALC-NaOH） 溶液进行处理，标本离心后，用PBS 洗涤1次，分为5份，分别用于集菌涂片法、罗氏培养法、PCR荧光探针法、Xpert MTB/RIF法及SAT法检测。

1.3.2 MTB检测根据《结核病诊断细菌学检验规程》[2]进行罗氏培养，以及抗酸染色。集菌涂片法、罗氏培养法、PCR荧光探针法及Xpert MTB/RIF法参考相应的试剂盒使用说明书进行操作。SAT法：将待检标本置于离心机中13 000 r/min 离心5 min，弃上清，加入50 ml 裂解缓冲液后重悬，放入超声清洗器超声处理15 min，超声功率为300 W。设置阳性对照为活的H37Ra 菌株，阴性对照为无菌水并与待检标本同步检测。其他步骤参考试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法

数据分析采用PEMS 3.0 统计软件，以罗氏培养法为金标准，计算SAT法敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和约登指数。计数资料以例 （%）表示，比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。以受试者工作特征 （receiver operator characteristic，ROC） 曲线评价Xpert MTB/RIF法和SAT法检测对MTB的诊断价值。

2 结果

2.1 不同检测方法检出MTB 结果比较

不同方法检测MTB的结果见表1。集菌涂片法与罗氏培养法比较，检出率低，差异有统计学意义 （χ2=4.966，P=0.026） ；PCR荧光探针法与罗氏培养法比较，差异无统计学意义 （χ2=0.285，P=0.594） ；Xpert MTB/RIF法与罗氏培养法比较，差异无统计学意义 （χ2=0.072，P=0.789） ；SAT法与罗氏培养法比较，差异无统计学意义 （χ2=0.018，P=0.893）。

表1 两组PTB患者经不同检测方法检出痰液中MTB 情况例 （%）

2.2 PCR荧光探针法、Xpert MTB/RIF法和SAT法的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及约登指数比较

以罗氏培养法为标准，PCR荧光探针法的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、约登指数分别为：65.96% （95% CI：51.89%，80.02%），70.59% （95% CI：59.48%，81.70%），60.78% （95% CI：46.92%，74.65%），75.00% （95% CI：64.10%，85.90%）和0.37；Xpert MTB/RIF法以上指标为：91.49% （95% CI：83.21%，99.77%），91.18% （95% CI：84.26%，98.09%），87.76% （95% CI：78.24%，97.27%），93.94% （95% CI：88.03%，99.85%）和0.83；SAT法以上指标为：95.74% （95% CI：89.75%，101.74%），98.53% （95% CI：95.59%，101.46%），97.83% （95% CI：93.45%，102.20%），97.10% （95% CI：93.04%，101.16%）和0.94。见表2。

2.3 Xpert MTB/RIF法和SAT法检测MTB的可靠性评价

以罗氏培养法为参照，Xpert MTB/RIF法和SAT法的AUC分别为0.925 （95% CI：0.869，0.981）和0.936 （95% CI：0.883，0.990）。SAT法的AUC 略高于Xpert MTB/RIF法。见图1。

表2 3种检测方法对115例PTB患者筛检结果例

图1 Xpert MTB/RIF法和SAT法检测MTB的ROC曲线

3 讨论

本研究以罗氏培养法为标准，对几种不同的检测MTB 方法进行比较。与罗氏培养法的检出率比较，集菌涂片法检出率较低，该结果与成松等[9]的研究结果基本一致。PCR荧光探针法是建立在PCR技术上的一种快速检测MTB技术，是以DNA为检测靶标，由于DNA 在自然环境中半衰期较长，不容易降解，容易产生污染，导致假阳性的出现。本研究中，PCR荧光探针法检出率高于罗氏培养法，但是阳性预测值较低，仅为60.78%，假阳性率较高。Xpert MTB/RIF法是由美国Cepheid公司开发一种结核病诊断技术，由于靶点是利福平突变序列，因此可以检测耐药性，并且实现诊断过程的自动化，操作简便，检验周期短。本研究中，Xpert MTB/RIF法检出率与罗氏培养法比较无差异，检验效能指标敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、约登指数略低于张灿强等[10]的报道，但趋势基本一致，可能受到样本数量，实验操作等因素的影响。Xpert MTB/RIF法各项检验效能指标均优于PCR荧光探针法。SAT法是一种新型核酸检测技术，该技术采用M-MLV 逆转录酶和T7RNA 多聚酶进行核酸扩增，相对于其他核酸扩增技术，反应抑制物更少，有效减少假阴性结果；采用实时荧光闭管检测，使污染得到有效控制，即使污染产生，由于扩增产物为RNA，环境中极易降解，从而大幅度提高检测结果的可靠性。其最大的优点在于直接以MTB特异性RNA为扩增靶标，以扩增产物RNA为检测靶标，由于RNA 仅在活菌中存在，MTB 死亡后RNA 降解，所以该方法可以作为活动性PTB及治疗效果的监测[11]。本研究中，SAT法的检出率略低于罗氏培养法，该结果与FAN 等[12]在2018年的报道基本一致。其阳性预测值高于Xpert MTB/RIF法，提示以RNA为模板的Set-TB 法有效降低假阳性率，其他检验效能指标与Xpert MTB/RIF法接近。SAT法各项检验效能指标均优于PCR荧光探针法。ROC曲线结果显示，2种检测方法的AUC 较大，均＞0.9，表明两者对MTB的检测准确性较高，具有较高的诊断价值，并且SAT法的AUC 大于Xpert MTB/RIF法。

综上所述，SAT法对痰标本中MTB的敏感性、特异性和准确度较高，具有较高的诊断价值，并能有效降低假阳性率，提高检测效率，操作简单，检测周期短，可以作为临床诊断参考。