不同时间单次定时输精对绵羊受胎率的影响

张 静，焦熙堯，高晓茜，张 然，甘叶明，李俊杰，李相运*

(1.河北农业大学 动物科技学院 河北省牛羊胚胎技术创新中心，河北 保定 071000；2.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021；3上海牧齐牧业科技有限公司，上海 201514)

绵羊的季节性发情和低产羔率是制约规模化羊场快速发展的瓶颈，为了人为控制绵羊发情，缩短世代间隔，减小工作量、简化管理、提高绵羊繁殖率和产羔率，增加规模化羊场经济效益，各个羊场和牧户普遍采用定时输精技术[1-3]，即利用外源激素控制和改变空怀母畜卵巢的活动规律，从而使其在预定时间内集中发情、排卵并在固定时间进行输精的一项技术。到目前为止，对绵羊定时输精技术的研究主要集中在使用激素的种类、生产厂家、处理方法等，其他方面特别是对于输精时间缺乏比较研究[4-6]。绵羊定时输精方法通常有2种：一种是开膣器阴道输精，另一种是腹腔镜子宫角输精。前者操作简便，容易推广，但母羊需要2次或者3次输精，工作量大，且公羊使用效率和受胎率(40%～70%)较低。后者只需单次输精，且公羊使用效率和受胎率高(80%～90%)，但不易推广、设备昂贵、对操作人员要求较高、对母羊子宫有损伤，也容易导致多羔(4羔及以上)出现，羔羊成活率降低。因此，当务之急是尽快建立一种简便高效的绵羊单次定时阴道输精技术。绵羊阴道定时输精常见的输精时间是在撤栓后36～58 h输精2次[7-9]。本试验以湖羊和乌珠穆沁羊为试验材料，采用单次阴道定时输精和腹腔镜子宫角输精的方法分别在36，48，58 h各输精1次，探索绵羊最佳阴道定时输精时间，为简化绵羊定时输精程序、减少工作量及大规模推广定时输精技术而提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验时间和动物试验地点有2处，一处是内蒙古锡林郭勒盟乌拉盖管理区，时间为2018年8-10月和2019年3-5月，另一处是河北承德围场，时间为2018年9月-2019年3月。选择2～5岁，体质量30 kg以上，膘情中等，无生殖道疾病的乌珠穆沁羊(内蒙古)和湖羊(河北)作为试验羊。湖羊全部舍饲，饲养管理条件一致，每天定时2次饲喂，粗饲料主要是青贮玉米，精饲料是全价日粮，粗饲料和精饲料粉碎混合均匀后饲喂。乌珠穆沁羊全部放牧，冬季补饲干草。

1.2 同期发情阴道埋植海绵栓(含45 mg氟孕酮，SYNCRITE-45 Vaginal Sponge，澳大利亚生产)当天记为0 d，于13 d撤栓，同时肌肉注射孕马血清促性腺激素(PMSG) 330 IU(PMSG，1 000 IU/瓶，宁波三生生物科技有限公司)，分别在撤栓后36，48，58 h输精。

1.3 定时输精采集6～8只杜泊公羊的新鲜精液，混合，加入脱脂牛奶5～7倍稀释，精子活力0.5以上，精子密度4×108/mL，置30℃水浴中保存。试验羊随机分为3组，分别在撤栓后的36，48，58 h输精。采用阴道输精时，试验羊倒立保定，用温生理盐水清洁外阴部，插入开膣器打开阴道，观察并定位子宫颈口，利用绵羊专用输精器(保定正木生物科技有限公司生产)吸取0.3 mL精液，注入子宫颈口内。采用腹腔镜子宫角输精时，试验羊禁食24 h，保定于固定架上，腹部向上，剔除乳房基部及腹部被毛，利用腹腔镜将0.2 mL精液注入两侧子宫角，每侧子宫角各0.1 mL。整个输精过程在2 h内完成。

1.4 促黄体素释放激素A3处理用生理盐水稀释促黄体素释放激素A3(LRHA3，25 μg/支，宁波三生生物科技有限公司生产)，质量浓度25 mg/L。根据前期试验结果，输精完成后，每只试验羊肌肉注射17 μg或25 μg LRHA3。

1.5 妊娠检查输精后40 d，由一名固定人员使用B超检测仪(DP-30Vet，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)经腹部对受配母羊进行妊娠检查，B超屏幕显示明显孕囊者认定为妊娠，以妊娠母羊占受配母羊的百分比计算受胎率。

1.6 数据分析利用Excel 2007进行数据分析，不同试验组绵羊受胎率之间的显著性检验采用卡方检验，P<0.05认定为差异显著。

2 结果

2.1 撤栓后不同时间单次定时阴道输精对湖羊和乌珠穆沁羊受胎率的影响随机挑选195只湖羊和201只乌珠穆沁羊，分别在撤栓后36,48,58 h单次阴道输精1次(表1)，随着输精时间的推迟，湖羊和乌珠穆沁羊的受胎率均显著提高(P<0.05)，并都在撤栓后的58 h得到最高受胎率(湖羊76.9%，乌珠穆沁羊72.3%)。在相同输精时间，湖羊与乌珠穆沁羊之间的受胎率没有显著性差异(P>0.05)。

表1 撤栓后不同时间单次定时阴道输精对湖羊和乌珠穆沁羊受胎率的影响

2.2 撤栓后不同时间腹腔镜子宫角输精对湖羊和乌珠穆沁羊受胎率的影响随机挑选1 020只湖羊和780只乌珠穆沁羊，分别在撤栓后36，48，58 h 借助腹腔镜进行子宫角输精(表2)，湖羊和乌珠穆沁羊在 36 h的受胎率显著低于 48 h和 58 h的受胎率(P<0.05)，而 48 h和 58 h 的受胎率在2个品种之间以及品种之内都没有显著性差异(P>0.05)。

2.3 LRHA3对湖羊和乌珠穆沁羊受胎率的影响随机挑选786只湖羊和700只乌珠穆沁羊，在撤栓后 58 h，湖羊采用阴道输精和子宫角输精，乌珠穆沁羊采用阴道输精，观察LRHA3对试验羊受胎率的影响(表3)。结果发现，对于湖羊，阴道输精时每只羊注射 17 μg或 25 μg LRHA3，受胎率显著降低(P<0.05)，而在子宫角输精时，注射17 μg或25 μg LRHA3对受胎率没有显著性影响(P>0.05)；对于乌珠穆沁羊，阴道输精时每只羊注射 17 μg或 25 μg LRHA3，受胎率显著提高(P<0.05)。不同剂量的LRHA3(17 μg和 25 μg)对湖羊和乌珠穆沁羊的受胎率没有显著性影响(P>0.05)。

表2 撤栓后不同时间腹腔镜子宫角输精对湖羊和乌珠穆沁羊受胎率的影响

表3 LRHA3对湖羊和乌珠穆沁羊受胎率的影响

2.4 定时输精对湖羊和乌珠穆沁羊产羔率的影响本试验统计了200只分娩湖羊(子宫角输精+ LRHA3)和200只分娩乌珠穆沁羊(阴道输精+LRHA3)的产羔(包括死羔)情况，结果显示湖羊有15只羊产单羔、46只羊产双羔、132只羊产三羔、6只羊产四羔、1只羊产五羔，产羔率266%；乌珠穆沁羊有161只羊产单羔、32只羊产双羔、5只羊产三羔、2只羊产四羔，产羔率124%。

3 讨论

3.1 撤栓后不同时间定时输精显著影响湖羊和乌珠穆沁羊的受胎率本试验探讨了撤栓后不同时间单次阴道定时输精和腹腔镜子宫角定时输精对湖羊和乌珠穆沁羊受胎率和产羔率的影响，同时也探讨了LRHA3在绵羊定时输精中的作用，结果发现湖羊和乌珠穆沁羊在撤栓后58 h单次阴道输精的受胎率显著高于撤栓后36 h和48 h的受胎率。二者在撤栓后48 h和58 h的腹腔镜子宫角输精的受胎率没有显著性差异，但也都显著高于撤栓后36 h的受胎率，这些数据表明不管采用何种输精方法，湖羊和乌珠穆沁羊的适宜输精时间是在撤栓后58 h。大多数关于绵羊定时输精的文献报道，输精时间都在撤栓后 36～58 h[10-13]，而且撤栓后58 h的受胎率普遍高于36 h和48 h的受胎率[14]。在繁殖季节，考力代羊埋栓(含300 mg孕酮)6 d，并在撤栓同时注射PMSG 300 IU和前列腺素 125 μg，采用阴道/子宫颈输精和腹腔镜子宫角输精法，在撤栓后54 h的受胎率为42.3%和56.9%，而在撤栓后48 h的受胎率为31.1%和44.1%，前者显著高于后者。采用阴道输精、子宫颈口深部输精和腹腔镜子宫角输精方法，新疆细毛羊在撤栓后24 h的受胎率分别为38.25%，43.12%和55.20%；在撤栓后72 h的受胎率分别为23.19%，30.45%，52.71%，都显著低于撤栓后36 h(49.30%，51.54%，59.09%)和48 h(42.83%，50.15%，90.79%)的受胎率[15]。下一步，我们计划在撤栓后58 h与72 h之间设置2个输精时间点以进一步观测湖羊和乌珠穆沁羊的单次定时阴道输精的受胎率，确定最佳输精时间。单次输精对于绵羊繁殖有较高风险，关键是确定适宜的输精时间和输精量，这对于绵羊规模生产中高效繁殖环节有重要意义。多浪羊鲜精单次输精后的产羔率达78.3%，与本交母羊相比差异不显著[16]。杜蒙羊撤栓后36 h鲜精输精2次或3次，受胎率没有显著性差异[17]。目前，绵羊定时输精多采用2次输精[8,10-11,18]，个别地区也有3次输精者，但输精次数的增多不仅增加了劳动强度，降低了公羊利用率，而且易造成母羊子宫疾患[16]。本试验在撤栓后58 h采用单次定时阴道输精方法，没有试情，既能充分利用优秀种公羊的精液，减少劳动量，简化生产管理流程，又能获得较高的受胎率和产羔率，适宜在绵羊养殖场(户)大规模推广应用。

3.2 促黄体素释放激素A3(LRHA3)对绵羊定时输精受胎率的作用LRHA3是人工合成的一种促性腺激素释放激素(GnRH)，它能促进排卵，提高排卵同期性[3,12]。然而，在绵羊撤栓后的24～44 h注射GnRH，妊娠率并没有得到提高，如果在单次定时输精的同时注射GnRH还会降低受胎率，在2次注射前列腺素诱导考力代羊同期发情和定时输精时，在第2次注射前列腺素后的24 h注射GnRH可降低人工输精后的妊娠率，而在36 h后注射GnRH对妊娠率没有显著性影响[7]。在山羊撤栓后的36 h注射GnRH并在48 h输精，受胎率也没有显著性提高[3,12]。本试验中，当湖羊采用阴道输精时，LRHA3显著降低受胎率，但采用腹腔镜子宫角输精时，LRHA3却没有影响受胎率；当乌珠穆沁羊采用阴道输精时，LRHA3却显著提高受胎率。本试验虽然没有观测乌珠穆沁羊在子宫角输精时LRHA3的作用，但这些数据也足以表明LRHA3的作用可能与诸多因素有关(如绵羊品种、营养状况、胎次、年龄、季节、饲养管理方式等)。在本试验中，湖羊为常年舍饲，而乌珠穆沁羊为常年放牧，这种不同的饲养管理方式可能也会影响LRHA3的作用。此外，在另外一个试验中，我们发现LRHA3显著降低湖羊胚胎移植成功率，这暗示LRHA3在促进排卵同期性的同时可能会抑制早期胚胎附植，下一步还需要设计更加精细的试验以进一步了解LRHA3对绵羊定时输精受胎率的影响。

3.3 PMSG在绵羊定时输精中的作用在绵羊同期发情和定时输精过程中，注射PMSG可增加排卵数和产羔率[19-20]。在撤栓前 2 d或撤栓同时注射 PMSG 500 IU 可使奥西米绵羊排卵数增加到2.33[19]；在撤栓前2 d或1 d或者撤栓同时注射PMSG 400 IU 可使墨西哥短毛绵羊的排卵数增加到3.3[21]；对东北细毛羊分别注射PMSG 1 200,1 000,800 IU，产羔率平均提高至182.6%[22];对甘肃高山细毛羊埋栓13 d，撤栓同时注射PMSG 600 IU，产羔率提高至150%[23];在藏绵羊选育核心群，埋栓12 d后撤栓，同时注射PMSG 500 IU，产羔率为119.27%，繁活率为114.11%[24]。对于山羊，注射PMSG也同样可以增加排卵数和产羔率。采用阴道海绵栓和PMSG相结合的方法，对63只空怀滩羊进行处理，结果表明：配种季节注射250 IU和非配种季节注射300 IU PMSG能有效诱导滩羊同期发情并增加排卵数，年繁殖率达187.3%，年只均繁殖成活羔羊1.59只[25]。湖羊和乌珠穆沁羊分别是我国著名的多胎羊和单胎羊品种，湖羊产羔率228.9%，乌珠穆沁羊产羔率100%。本试验中，湖羊和乌珠穆沁羊的产羔率分别达到266%和124%，显著高于自然妊娠产羔率，表明同期发情和定时输精技术可以显著提高绵羊产羔率。然而，也有报道认为，虽然PMSG能够增加排卵数，但却并不能提高产羔率[21]。杜泊羊注射PMSG 300 IU组与未注射PMSG组的产羔率分别是150%和140%[26]；阿华西羊注射PMSG 600 IU，虽然多胎率有所增加，但总产羔率并没有显著提高[27]；这些数据表明：卵巢对于PMSG的反应可能非常敏感，不同品种之间甚至同一品种不同个体之间对于同一剂量的PMSG反应都不相同，此外，季节、营养、注射时间等也会影响PMSG的作用[28]。

在畜牧生产中，定时输精是一项非常重要的繁殖管理手段，它既免去了发情鉴定环节，又解决了母畜产后不发情问题，从而可明显提高畜牧业的经济效益。在今后一段时期内，同期发情与定时输精技术必将成为家畜繁殖技术研究的热点[15]。