电喷雾-串联四级杆-飞行质谱法分析津新乌鲫中的一种二肽

2020-09-27 23:03杨建新金华朱振秀俞丽高永平金万昆田颖刚
河北渔业 2020年9期
关键词:甲酸质谱法乙腈

杨建新 金华 朱振秀 俞丽 高永平 金万昆 田颖刚

摘 要:津新乌鲫(Carassiusauratus var.Jinxin Black)是具有较高营养和食用价值的鲫鱼新品种,为分析其肌肉中的小肽及其结构,建立了电喷雾-串联四级杆-飞行质谱分析津新乌鲫中的一种二肽Tyr-Ser的方法,优化了津新乌鲫提取物的色谱分离条件。采用Agilent Zorbax Rx-C8柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液(V∶V=2∶98),0.8 mL/min等度洗脱,采用ESI-QTOF对其中一种二肽进行鉴定,证实二肽为Tyr-Ser。

关键词:津新乌鲫(Carassiusauratus var.Jinxin Black);高效液相;电喷雾质谱;二肽

在现代科学研究中,质谱分析技术在生命科学领域得到了广泛应用和发展,在蛋白质组学和多肽的研究中,质谱分析已成为鉴定蛋白质和多肽类的重要手段[1]。目前在分析中常用的有基质辅助解吸电离-飞行时间质谱法(MALDI-TOF)、电喷雾串联质谱法(ESI-MS/MS)和离子阱质谱法(IT-MS)[2]。ESI-QTOF是在电喷雾质谱仪的基础上,采用双重四级杆与飞行时间质量分析器串联,具有较好的分辨率和灵敏度[3]。ESI-TOF-MS不仅可以在离子传输区域进行碰撞诱导解离,还可以在源后衰变时提供分子的结构信息。因此,TOF-MS与ESI-MS联用技术在生物大分子研究中具有广阔的前景。TOF-MS技术在蛋白质及其多肽的研究中具有可鉴定蛋白质功能﹑研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用﹑比较蛋白质组的表达差异﹑研究蛋白磷酸化和糖基化等功能[4-6]。

津新乌鲫(Carassiusauratus var.Jinxin Black)是天津市换新水产良种场以白化红鲫(Carassius auratus,white type)和墨龙鲤(Cyprinus carpio var. Molong)为原始育种亲本,通过杂交育种技术育成的国内首个集观赏与食用为一体的全黑体色鲫鱼新品种(登记号:GS-02-002-2013)[7]。已有研究证明津新乌鲫鱼体中含有较高含量的多不饱和脂肪酸;鱼体中的氨基酸总量和必需氨基酸含量明显高于鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、草鱼(Ctenopharyngodon idella)、鲤(Cyprinus carpio)和鲫(Carassius auratus auratu)等常见养殖鱼类。这说明津新乌鲫是一种具有较高营养和食用价值的优良养殖品种[8]。本实验采用了液相分离和电喷雾-串联四级杆-飞行质谱分析法,对津新乌鲫提取物中的小肽进行了分析鉴定,方法简便、快速,所建立的方法对于津新乌鲫提取物的分析和结构鉴定具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品制备

试验材料为津新乌鲫,取自天津市换新水产良种场,体重900~1 200 g。称取津新乌鲫18尾,放血处死,去鱼鳞、内脏、鱼头,洗净,用组织捣碎机绞碎,准确称取津新乌鲫的肉泥2 g,加入约6 mL的提取液(5%乙腈-95%甲酸溶液(0.1%甲酸)),置于离心管中于室温下超声萃取1 h(频率:40 kHz,功率:50 W),10 000 r/min离心10 min,收取上清液。取3 mL上清液加入體积分数2%三氟乙酸,10 000 r/min离心5 min。取上清液200 μL,用色谱级的超纯水稀释至约1.5 mL,稀释后的液体用0.22 μm微孔滤膜过滤,滤液置于4 ℃保存。实验做三组平行样。

1.2 仪器与试剂

安捷伦1290系列高效液相色谱仪(美国安捷伦公司,南昌大学国家重点实验室公共实验平台),6538UHD三重四级杆飞行质谱仪(美国安捷伦公司,南昌大学国家重点实验室公共实验平台),安捷伦色谱柱Agilent Zorbax Rx-C8(4.6 mm×250 mm,5 μm),Milli-Q超纯水处理系统(美国 MLlipore公司),XB电子分析天平(Precise瑞士),AnkeTGL-16C;离心机(上海安亭科学仪器厂),KQ3200E超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司)。

乙腈(HPLC,美国新天地),三氟乙酸(HPLC,阿拉丁),甲酸(AR,国药),有机滤头(0.22 μm)。水为HPLC级的超纯水。

1.3 液相及质谱条件

色谱柱:Agilent Zorbax Rx-C8(4.6 mm×250 mm),流动相:2%乙腈-98%甲酸溶液(甲酸0.1%),0.8 mL/mL等度洗脱,DAD进行190~400 nm扫描。

质谱分析条件:

离子源:ESI源;离子模式:正离子;干燥气温度:350 ℃;干燥气流速:10 L/min;雾化气压力:40 psi;扫描范围:m/z 50~1 000;毛细管出口电压:80~150 V;锥孔电压:50 V;二级MS碰撞能10~40 V。实验数据采用Agilent Mass Hunter Workstation软件处理。

1.4 分析方法

采用乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相,对不同体积分数的乙腈进行了筛选。分别采用20%乙腈-80%甲酸溶液、10%乙腈-90%甲酸溶液、5%乙腈-95%甲酸溶液、2%乙腈-98%甲酸溶液等进行流动相的选择。

选择合适的流动相后,采用电喷雾-串联四级杆-飞行质谱,首先用TOF-MS模式进行全扫描分析,通过改变毛细管出口电压80~150 V,得到二肽的[M+H]+或[M+2H]2+准分子离子峰后,再利用正离子离子扫描模式对[M+H]+进行MS/MS分析[9]。二级MS碰撞能10~35 V。

2 结果与讨论

2.1 液相洗脱条件选择、优化结果

应用RP-HPLC分离蛋白质和肽,通常在流动相中加入酸性抑制剂,以调节流动性的pH值,改善峰的峰形和分离度。本实验加入0.1%甲酸,有利于分离,且在电喷雾质谱中可以优化电离。在0.1%甲酸的条件下进行等度洗脱,比较了乙腈体积分数分别为20%、10%、5%及2%的分离情况(见图1)。结果表明,采用20%和10%乙腈作为流动相时,各个峰不能得到很好的分离(见图1a、b),以5%乙腈作为流动相时,各个峰基本实现分离,但是各个峰分布较为紧密,不利于电喷雾质谱上对峰进行鉴定与分析(见图1c),而用2%乙腈洗脱时,各组分能实现很好的分离,且保留时间适中(见图1d),可用于电喷雾质谱上对各个峰进行分析与归属。

2.2 色谱峰的归属结果

津新乌鲫样品质谱的总离子流图及高效液相的色谱图见图2。利用电喷雾—串联四级杆—飞行质谱对液相分离的组分进行结构鉴定,在正离子模式下,由图3可知二肽的准分子离子峰为m/z 269.088 2,[M+H]+,即二肽的分子量M为268.080 4,m/z 291.069 9是[M+Na]+,m/z 559.150 3为[2M+Na]+,其中m/z 137.045 8为[Tyr-COOH+H]+,m/z 269.088 2与m/z 137.045 8之差132.042 4为Ser氨基脱氢连接肽键的部分加上一个H+。为进一步确定结构,再利用正离子离子扫描模式对[M+H]+进行MS/MS分析。

通过调节二级MS碰撞能10~40 V,对m/z 269.087 7和m/z 137.045 8进行分析,获得一系列MS/MS图,分析可知其中m/z 137.045为[Tyr-COOH+H]+,列举其中图4,其中m/z 94.039 7为[C6H5O+H]+,为二肽中Tyr部分中苯羟基断裂后加H+,m/z 110.034 8为[C7H7+H2O+H]+,为Tyr中烷基苯加水加H+,m/z 119.036 3为[C8H8N+H]+,即为Tyr部分失去-COOH后脱一分子水后加H+,[Tyr-COOH-H2O+H]+。

对m/z 269.087 5进行二级MS分析,列举如图5,分析可知m/z 60.044 9为[C2H5NO+H]+,即为二肽肽键中间断裂,Ser部分再失去-COOH后加H+,即[Ser-COOH-H+H]+,m/z 94.041 5为 [C6H5O+H]+,m/z 137.045 8为[Tyr-COOH+H]+。对一系列由二级MS碰撞能10~40 V获得的MS/MS片段见表1。

通过ESI-QTOF对津新乌鲫中的二肽分析为Tyr-Ser,分子式为C12H16O5N2,分子量为268.105 5,结构式见图6。

2.3 讨论

本研究中采用反相色谱法对津新乌鲫肌肉中的小肽进行了分离,并采用ESI-QTOF质谱对津新乌鲫中二肽进行了一级结构鉴定及MS/MS分析,通过改变毛细管出口电压,得到二肽准分子离子峰后,再选择适当的二级碰撞能量,利用正离子离子扫描模式对二肽进行MS/MS分析,进而确定了其结构。目前,在蛋白质组学领域研究中,质谱已成为鉴定蛋白质及多肽的最重要技术平台之一。韩超等采用ESI-TOF/MS分析了太子参中的环肽类化合物,通过电喷雾-飞行时间质谱获得了化合物的准确分子量信息,并对结构进行了鉴定[10]。周红华等应用ESI-MS及源内碰撞诱导解离技术对肽类药物曲普瑞林及促黄体素释放激素类似物进行测定,确证了其氨基酸序列和分子量以及寡肽的一级结构[11]。陈瑶函等对质谱软电离技术在完整糖肽分析中的应用进行了研究,通过MALDI-MS/MS和ESI-MS/MS对目标糖蛋白进行分析,获得了糖肽的糖链结构信息[12]。结合本次实验结果表明电喷雾-飞行时间质谱为多肽类化合物分子量及一级结构的确证,提供一种高效准确、灵敏快速的手段。

已有研究证明津新乌鲫中含有较高含量的多不饱和脂肪酸,并且津新乌鲫中的氨基酸总量和必需氨基酸含量明显高于鲢、草鱼、鲤和鲫等常见养殖鱼类,证实津新乌鲫是一种具有较高食用价值和保健作用的优良养殖品种,具有广阔的开发前景[8]。本次实验首次对津新乌鲫中的小肽进行了液相分离和电喷雾-串联四级杆-飞行质谱分析,证实了小肽结构为Tyr-Ser。韩国专利表明Tyr-Ser是一种具有美白功能的二肽,其分子量较小,对细胞的通透性较好,在化妆品产品中具有开发前景[13]。本次研究将为津新乌鲫的营养价值及商品开发价值提供理论基础。

致谢:本实验得到南昌大学食品科学与技术国家重点实验室赵溪雁、牛俊卿、廖春艳同学的大力帮助,特此致谢!

参考文献:

[1] 张晓楠.质谱在多肽氨基酸序列分析中的应用[J].河北化工,2005(6):69-70.

[2] Shevchenko A,Jensen O N,Podtelejnikov A V,et al.Linking genome and proteome by mass spectrometry:Large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels[J].Proc Natl Acad Sci,USA,1996a,93(25):14440-14445.

[3] 王英武,王玲,顾景凯,等.电喷雾—串联四级杆—飞行时间质谱法分析寡肽的一级结构[J].分析化学,2003,31(6):709-712.

[4] 王晓娜,许丽娜,彭金咏,等.现代生物质谱技术在生物大分子分析研究中的应用[J].中国现代应用药学,2008,25(2):105-109.

[5] 杜晓宁,宋明鸣.多肽类物质分析检测方法的研究进展[J].上海化工,2009,34(11):6-11.

[6] 王小平,容蓉,田景振.多肽類药物分析方法的研究进展[J].食品与药品,2009,11(9):55-58.

[7] 金万昆,高永平,俞丽,等.红鲫♀×乌龙鲫F2(4 n)♂回交F1的倍性及黑体色表现的观察[J].淡水渔业,2012,42(2):88-92.

[8] 金万昆,杨建新,杜婷,等.乌龙鲫的肌肉营养成分、氨基酸含量及脂肪酸组成分析[J].河北渔业,2009,191(11):12-14.

[9] 蒋菁莉,徐彦军,娄飞,等.反相高效液相色谱—电喷雾质谱法分析食源血管紧张素转换酶抑制肽[J].分析化学,2007,35(3):427-430.

[10] 韩超,陈军辉,刘劼,等.高效液相色谱/电喷雾飞行时间质谱分析太子参中环肽类化合物[J].分析化学,2006,34(12):1719-1722.

[11] 周红华,马仁玲,严立勇,等.电喷雾质谱法(ESI-MS)分析两种寡肽的一级结构[J].药物分析杂志,2006,26(3):374-376.

[12] 陈瑶函,晏国全,周新文,等.基质辅助激光解吸电离质谱和电喷雾电离质谱在辣根过氧化物酶糖肽结构分析中的应用[J].色谱,2010,28(2):135-139.

[13] Park So-Hee,Lee Hyun-Kyung,Choi Hye-Ryung.Skin-whitening composition containing dipeptide[P].WO 2011126163,2011-10-13.

(收稿日期:2020-07-20;修回日期:2020-08-23)

猜你喜欢
甲酸质谱法乙腈
原料药中残留甲酸的检测方法
丁二烯抽提装置乙腈精制再生技术开发
多接受电感耦合等离子质谱法准确测定天然地质样品中的锂同位素组成
农产品中氨基甲酸酯类农药检测液相色谱条件优化研究
全蒸发顶空—气相色谱—质谱法快速测定塑料玩具中的致敏性芳香剂
气相色谱-质谱法检测食品中的丙烯酰胺
光化学反应—串联质谱法鉴定细胞中不饱和卵磷脂双键的位置
藏毯羊毛红花染色的研究
共沸精馏提浓稀甲酸溶液
头孢克肟残留溶剂的测定