响应面法优化枸杞甜菜碱超声提取工艺

冯 蕾 林宇琪 林 雪 刘俊霞

（吉林农业科技学院生物与制药工程学院，吉林吉林 132101）

枸杞（Lycium barbarum）为茄科植物枸杞的成熟果实，是传统药食同源药材[1]。枸杞子味甘、性平、归肝、肾经，有生精、补肾、保肝、明目、延缓衰老等功效[2]。这些药用功效多与枸杞的抗氧化成分有关。甜菜碱是一种季铵型水溶性生物碱，是枸杞的主要活性物质，具有降血压、抗脂肪肝、抗肿瘤、抗癌、增强免疫力、增进食欲等作用[3]。甜菜碱还具有促进脂肪代谢、调节渗透压、抗应激等功效[4]，已作为一类新型饲料添加剂实现工厂化生产，被广泛用于动物养殖业中。

响应面法（Response Surface Methodology，RSM）是近年来广泛应用的一种实验条件优化的方法，包括实验设计、模型建立、模型验证等步骤。该方法通过合理的实验设计以及多元二次回归方程拟合分析，同时借助直观等高线图和三维立体图分析各变量之间的交互作用，最终实现各因素水平的最优组合[5]。本文旨在采用超声提取法提取枸杞中的甜菜碱，通过单因素实验和响应面法对其工艺进行优化，使用分光光度法测其含量，旨在为枸杞中甜菜碱的综合利用提供参考。

1 材料及仪器

1.1 材料 枸杞子购自当地药店。甜菜碱对照品（批号：894-20001）由成都曼思特生物有限公司生产。3%雷氏盐溶液的配制过程：称取水合雷纳克酸铵0.75 g，加水25 mL，搅拌使溶解，过滤，备用（当天配制）。

1.2 UV 5100型紫外 可见分光光度计由上海元析仪器有限公司生产，WGL-230B电热鼓风干燥箱由上海沪粤明科学仪器有限公司生产，AX324ZH电子天平由奥豪斯仪器有限公司生产，KQ-700V超声波清洗器由昆山舒美超声仪器有限公司生产，R1001-V旋转蒸发仪由郑州长城工贸有限公司生产，SHB-III循环水式多用真空泵由郑州长城科工贸有限公司生产。R509B恒温浴锅由上海豫康科教仪器设备有限公司生产，HH-4系列数显恒温水浴锅由金坛市科析仪器有限公司生产。

2 方法与结果

2.1 枸杞的处理 将枸杞洗净冻干后粉碎，过40目筛，放置于干燥器中备用。

2.2 枸杞甜菜碱的含量测定

2.2.1 制备溶液 ①对照品溶液的制备。取取甜菜碱对照品10 mg，放入 10 mL 的容量瓶，使用 0.1 mol/L 的盐酸溶液定容，制得对照品溶液浓度为1.0 mg/mL，冷藏备用。②供试品溶液的配置。称取枸杞粉末2.0 g，加入75%乙醇15 mL置具塞三角瓶中，提取时的超声温度为50℃，功率100 W，超声提取30 min，提取两次，合并滤液，浓缩后用蒸馏水定容于10 mL容量瓶中。

2.2.2 得到枸杞甜菜碱标准曲线 分别精密吸取对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于具塞试管中，冰水水浴 10 min，分别加入2.5%的雷氏盐溶液各6.0 mL，加0.1 mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，置冰浴中放置1 h，干燥滤纸滤过。沉淀后用70%的丙酮溶解，定容于10 mL容量瓶中。空白对照使用70%丙酮，在波长525 nm的情况下测定吸光度[6]，得到线性方程Y=1.057 8X+0.079 4，横坐标X为吸光度值，纵坐标Y为浓度，相关系数r=0.997 2，表明枸杞甜菜碱在0.4～1.2 mg/mL的线性关系良好。

2.2.3 测定枸杞甜菜碱的含量 将使用上述方法得到的溶液转移至烧杯并滴加浓盐酸至pH=1，加入1 g活性炭粉末，加热煮沸后放冷滤过。重新配置的雷氏盐溶液浓度为1.5%，量取10 mL加入滤液中，搅拌均匀，转移至25 m的L比色管中，加蒸馏水至刻度线。放入冰水中水浴3 h，沉淀析出滤过，用少量冰水冲洗沉淀，一并滤过。将沉淀转移至烧杯中，加入5～7 mL左右的70%丙酮，搅拌溶解，转移至10 mL的容量瓶中，再按上述方法测出吸光度值（A）。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度 甜菜碱供试品溶液1.0 mL，按照“2.2.3”中的操作方法测定6次，根据吸光度值计算RSD值。RSD值为0.65%，表明检测仪器的精密度良好。

2.3.2 稳定性 取枸杞甜菜碱待测液溶液，分别测定供试品在0～180 min的吸光值，并记录。RSD值为1.72%，表明供试品溶液在0～180 min内的稳定性较好。

2.3.3 重复性 6份甜菜碱提取液，按照“2.2.3”的操作方法，使用紫外分光光度计在525 nm处测定枸杞甜菜碱的吸光度值，计算RSD值。RSD值为0.67%，表明本试验方法的重复性较好。

2.3.4 加样回收率 取6份同一枸杞甜菜碱提取液标好序号，分别加入1.0 mL对照品溶液，按照“2.2.3”的操作方法在紫外分光光度计525 nm处测定吸光度值，根据回收率计算出RSD值，如表1所示。

2.4 响应面法优化枸杞甜菜碱超声提取工艺 在超声提取法单因素试验的基础上，选取乙醇浓度，液料比、提取时间3个因素，通过Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken的响应面设计和数据分析，具体试验因素与各水平值见表2、表3。

表1 加样回收率分析表（n=5）

表2 枸杞甜菜碱提取试验Box-Benhnken结果数据表

表3 甜菜碱Box-Benhnken试验回归模型方差分析表

根据表2中的数据，在Design-Expert软件中得到多元拟回归二次方程：

F值（64.8）和P值（＜0.0001）表明所建模型具有统计学意义。调整后的确定系数（Adj R2）和测定系数R2分别为0.97和0.988 1，与实验数据吻合较好。变异系数（6.65%）也证实了模型的良好重现性。通过二阶多项式模型的显著性（P＜0.05），研究了乙醇浓度、液料比和提取时间3个自变量对甜菜碱提取率的影响。变量F和P的值越低，对响应的影响就越大。从表2可以看出，乙醇浓度（A）和液料比（B）对响应有极显著影响（P＜0.01）；提取时间（C）对响应有显著影响（P＜0.05）。甜菜碱提取率的三维响应面如图1所示。

使用Design-Expert 8.0.6软件优化后的枸杞甜菜碱取率最高为1.6508%，提取时间为25.09 min，乙醇浓度为67.97%，液料比为7.86∶1。考虑到实际操作情况，得出最佳提取工艺为：超声时间25 min，提取温度70℃，料液比8∶1，乙醇浓度68%，提取2次。

2.5 最佳提取条件的确定及验证 利用Design-Expert V8.0.6.1软件对超声提取枸杞中甜菜碱工艺参数进行优化组合，确定最佳工艺条件为：超声时间25 min，提取温度70℃，料液比8∶1，乙醇浓度68%，提取2次。在最佳条件下进行验证试验，枸杞中甜菜碱得率的实际值为1.63%，预测值为1.615%，实际值与预测值基本相符条件下进行验证试验，实际值与预测值基本相符。因此，该预测模型具有实用性和准确性。

图1 甜菜碱提取率的三维响应面

3 结语

本试验采用超声提取法和Box-Benhnken试验设计对枸杞中甜菜碱的提取工艺进行了优化，为从枸杞中提取甜菜碱提供了一种相对简单、经济、高效的方法，可用于开发功能性食品和保健品。