滴鼻感染甲型流感病毒对BALB/c和C57BL/6J小鼠自发行为学的比较研究①

周艳琳 谷李铭 李康生 王革非

(新乡医学院三全学院病原生物学与免疫学教研室，新乡 453003)

流感病毒主要通过呼吸道感染宿主呼吸系统，引起呼吸系统疾病[1，2]。在部分感染人群中会出现一定程度的中枢神经系统(central nervous system，CNS)组织病变和功能障碍，其中一个重要的并发症是流感急性脑病(influenza acute encephalopathy，IAE)，流感病毒感染后，患者出现1～2 d的呼吸道症状，伴随严重的神经症状，并快速发展为认知障碍、精神状态改变，严重时引起神经后遗症甚至死亡[3-5]。

旷场试验也称敞箱实验，是评价小鼠自发活动行为和焦虑状态的经典行为学方法，被广泛应用于精神神经药理学、神经行为学等的基础研究，用于定量评价小鼠的自发活动、探索行为及焦虑、抑郁状态[6，7]。小鼠体质量的变化可以反映流感病毒PR8滴鼻感染是否对小鼠食欲造成影响；运动总路程反应小鼠在旷场实验中运动量的大小，运动量大表明其中枢神经系统兴奋，反之，则表明出现一定程度的抑郁状况；周边区域是小鼠的偏爱区域，周边区域的活动频率可反映小鼠的趋避性。

有关呼吸道外周感染流感病毒对CNS调控的认知、学习、空间记忆等行为的实验动物研究少有报道。因此，有必要建立流感病毒外周滴鼻感染的有效动物模型，进一步研究流感病毒呼吸道感染对患鼠空间记忆、学习认知、探索行为和抑郁情绪的影响。本研究以甲型流感病毒毒株H1N1 PR8分别感染C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠，采用旷场自发试验检测C57BL/6J和BALB/c小鼠在感染急性期内体质量变化情况及在旷场行为箱内的自发行为运动情况，研究哪种小鼠更适合做流感病毒感染的模型小鼠，为进一步探究流感病毒感染对CNS损伤的机制及伴随的学习、记忆、抑郁焦虑等行为学影响奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 C57BL/6J雄性小鼠，12周龄，体质量20～24 g，共20只；BALB/c雄性小鼠，12周龄，体质量24～28 g，共20只。小鼠均购于广东省医学实验动物中心，先饲养1～2周以适应新环境。本研究遵循国家及实验动物单位制定的有关实验动物福利的规则和制度。

1.1.2试剂与仪器 TRIzol、M-MLV kit、SYBR Green SuperMix购自Invitrogen公司；IL-1β、TNF-α、CXCL10、BDNF、GAPDH引物购自QIAGEN公司；ABI7500荧光定量PCR仪购自ABI公司。

1.1.3流感病毒毒株 H1N1病毒株A/Puerto Rico/8/34(简称 PR8)，由广东省汕头大学医学院微生物与免疫学教研室实验室保存，病毒滴度为1.2×107pfu/ml。病毒实验均在动物生物安全三级实验室(ABSL-3)中进行。

1.1.4旷场实验动物行为学分析系统 ZS-ZFT型旷场实验动物行为学分析系统(北京众实迪创生物科技有限公司)由硬件和软件两部分构成。硬件仪器主要由一个为20 cm×20 cm×30 cm的封闭箱子组成，箱子顶部中央安置摄像机，与记录系统相连接，记录小鼠在旷场中的运动情况，如总路程、中央区域运动路程、周边区域运动路程等[7]。

1.2方法

1.2.1动物处理 将C57BL/6J和BALB/c小鼠分别随机分为2组，即C57BL/6J小鼠H1N1 PR8感染组(简称PR8组)和C57BL/6J小鼠生理盐水对照组(简称CON组)，BALB/c小鼠H1N1 PR8感染组(简称PR8组)和BALB/c小鼠生理盐水对照组(简称CON组)，每组10只，做好标记。5%水合氯醛(0.004 ml/g)轻度麻醉后，滴鼻感染小鼠，50 μl/只，逐日观察小鼠发病情况，记录小鼠体质量变化。

1.2.2旷场自发试验 每天上午9∶00～11∶00检测小鼠在旷场行为箱行为运动情况，总时间5 min，连续检测7 d。

1.2.3小鼠脑组织RNA的提取及反转录 在感染后的第7天处死小鼠，取脑组织，TRIzol法提取脑组织RNA，M-MLV kit反转录为cDNA，用于qPCR检测。

1.2.4小鼠脑组织炎症因子的qPCR检测 使用SYBR Green qPCR SuperMix试剂盒，以GAPDH为内参对脑组织中的炎症因子TNF-α、IL-1β、CXCL10(C-X-C motif Ligand 10)、BDNF(brain derived neurotrophic factor)进行转录水平检测。qPCR反应体系为20 μl，操作步骤按照Invitrogen公司说明书进行。

2 结果

2.1小鼠体质量变化 图1A为流感病毒PR8(1∶500)感染C57BL/6J小鼠后7 d内的体质量变化。结果显示：C57BL/6J小鼠感染PR8后，小鼠体质量逐渐下降，在感染后的第3、4、5、6、7天，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.001)，在第7天处死的当天，10只小鼠仅6只存活，生存率为60%；图1B为流感病毒PR8(1∶100 000)感染BALB/c小鼠后7 d内的体质量变化。结果显示：BALB/c小鼠感染PR8后，小鼠体质量逐渐下降；在感染后的第6、7天，与对照组差异具有统计学意义(P<0.001)；10只小鼠全部存活，生存率为100%。前期实验数据表明，甲型流感病毒PR8 以1∶500稀释度感染BALB/c小鼠，可引起小鼠全部死亡。后逐渐扩大稀释倍数，最终甲型流感病毒PR8采用1∶100 000稀释倍数感染BALB/c小鼠，小鼠可全部存活，便于后期实验开展。提示流感病毒PR8感染后，两种小鼠体质量均下降，但BALB/c小鼠比C57BL/6J小鼠对流感病毒PR8更敏感。

图1 滴鼻感染PR8对两种品系小鼠体质量的影响Fig.1 Effect on weight of two strains mice infected intranasally with PR8

2.2运动总路程 图2A是C57BL/6J小鼠在旷场行为箱体中运动总路程，结果显示：CON组C57BL/6J小鼠运动量逐日减少，从第4天开始增加，符合小鼠自发活动的总路程先强后弱后又恢复的时相特点，与啮齿类动物在新环境中先探索后熟悉环境的特点相符，表明小鼠旷场行为学研究造模成功；PR8感染组C57BL/6J小鼠行走总路程逐日减少，差异无统计学意义(P>0.05)。图2B是BALB/c小鼠在旷场行为箱体中运动总路程，结果显示：PR8感染组BALB/c小鼠行走总路程逐日减少，并无恢复趋势，且在感染后的第6天，与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，在感染后的第7天具有极显著统计学意义(P<0.001)。提示PR8感染BALB/c与C57BL/6J均可引起小鼠自主活动能力减弱，但BALB/c小鼠在感染后的第6、7天更加明显，证实流感病毒PR8对于BALB/c小鼠自主活动能力的影响更加显著。

图2 滴鼻感染病毒PR8后两种品系小鼠在旷场实验中的总运动路程Fig.2 Total distance movement of two strains mice infected intranasally with PR8 in open field test

2.3周边区域运动路程 图3是BALB/c小鼠在旷场自发试验中周边区域行走路程，结果显示，在感染后的第7天，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.001)，虽然前6 d差异无统计学意义(P>0.05)，但PR8 treatment 统计学差异显著(P<0.001)。提示流感病毒PR8感染BALB/c小鼠引起小鼠趋避性增强，抑郁性增强，且在感染的急性期即第7天最为显著。

图3 BALB/c小鼠在旷场实验中的总周边运动路程Fig.3 Distance movement of BALB/c mice in out ring in open field test

2.4平均运动速度 图4是BALB/c小鼠在旷场自发试验中一周内平均运动速度情况。与对照组相比，在感染的第6、第7天差异均有统计学意义(P<0.01)。表明流感病毒PR8感染BALB/c小鼠引起活动性减弱可能伴有小鼠肌肉酸痛无力等运动生理改变而影响运动情况。

图4 滴鼻感染病毒PR8后BALB/c小鼠在旷场实验中平均运动速度Fig.4 Average movement speed of BALB/c mice in open field test infected intranasally PR8

2.5滴鼻感染流感病毒刺激BALB/c小鼠CNS炎症因子转录水平变化情况 滴鼻感染流感病毒PR8可引起BALB/c小鼠在感染后第7天伴随脑组织促炎因子、趋化因子、脑源性神经营养因子转录水平上调(图5)。其中促炎因子TNF-α转录水平上调程度最高(P<0.01)，IL-1β变化与对照组相比差异性不显著；趋化因子中CXCL 10的转录水平显著上调(P<0.05)；脑源性神经营养因子BDNF转录水平显著上调(P<0.05)。表明滴鼻感染流感病毒PR8引起BALB/c小鼠CNS发生以促炎因子、趋化因子及脑源性神经营养因子过度释放为主要特征的细胞因子风暴，引发神经系统功能紊乱，引起自发行为的降低，并伴随焦虑、抑郁等情绪障碍。

图5 BALB/c小鼠在CNS中炎症因子的转录水平变化Fig.5 Transcript levels of inflammatory factors of BALB/c mice in CNS

3 讨论

临床中，流感病毒感染除引发呼吸道症状外，亦会对CNS造成多种类型的流感相关脑症综合征，主要表现为情绪障碍、学习认知下降、行为改变及自身免疫脑病等[3-5]。Jurgens等[8]发现流感病毒H1N1 PR8感染C57BL/6J小鼠在急性期可诱发神经炎症、改变海马神经元形态、损伤学习认知能力。课题组前期研究发现，流感病毒H1N1 WSN33外周滴鼻感染BALB/c小鼠，可引起小鼠在感染的急性期和恢复期自发行为改变，并伴随抑郁、焦虑、紧张等情绪[7]。本研究对比非嗜神经性流感病毒H1N1 PR8滴鼻感染两种近交系小鼠C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠对旷场自发行为的敏感性，结果表明滴鼻感染流感病毒PR8可引起小鼠在急性期体质量下降，肌肉酸痛活动性降低，伴随明显的抑郁焦虑情绪；BALB/c小鼠对流感病毒PR8的敏感度较C57BL/6J小鼠明显，更适宜做流感病毒PR8感染的模型小鼠。此实验中小鼠的周龄和性别需要保持一致，雌性小鼠有动情周期，激素水平可能会影响行为，因此本实验全部采用雄性小鼠[9]。前期进行预实验分别以1∶500、1∶5 000、1∶50 000稀释流感病毒PR8原液，外周滴鼻感染BALB/c小鼠，发现其生存率分别为0、10%、50%，而甲型流感病毒PR8以1：500稀释度感染C57BL/6J小鼠，小鼠的生存率为60%，BALB/c小鼠比C57BL/6J小鼠对流感病毒PR8更敏感。

小鼠自主活动行为的改变与小鼠CNS损伤相关，有研究表明，幼年时期抑郁焦虑情绪会诱发成年后空间记忆、学习认知等行为障碍[10]。本研究为进一步研究流感病毒PR8感染对小鼠空间记忆、学习认知、情绪等提供模型BALB/c小鼠，具有重要科学意义。目前较多学者认为流感病毒外周感染引起小鼠CNS损伤，可能与体内免疫分子的级联反应导致的“因子风暴”有关，或与呼吸道或肠道微生物菌群环境变化打破菌群平衡有关[11-13]。本研究中患鼠不但伴有自发行为降低，抑郁、焦虑等情绪障碍，且CNS中促炎因子、趋化因子及脑源性神经营养因子在转录水平均出现不同程度的变化，表明流感病毒外周感染诱发的“细胞因子风暴”与中枢神经系统功能紊乱有关，但流感相关脑病的具体病理机制有待进一步的探究。这是否与流感病毒感染后呼吸道或肠道微生物菌群平衡打破存在相关性还有待明确，为进一步研究流感相关脑病的病理机制提供依据。