细胞培养实验平台的管理经验探索

左琴华，薛 巍

（暨南大学 生物医学工程系 生物材料广东高校重点实验室，广东 广州 510632）

细胞培养也叫细胞克隆技术，通过在体外模拟细胞在体内的特定生长环境，使得单个或者细胞群能够在体外生存、繁殖，维持其结构和功能的完整性，该技术已经广泛应用于细胞工程[1]、基因工程[2-3]和生物医学工程[4-5]等研究领域，并且成为从事生物医学工程研究领域的科研技术人员所必须掌握的一项技术。据统计，近几年暨南大学生物医学工程系80%以上研究生的课题研究均涉及细胞培养技术，体现了细胞培养技术在生物医学工程研究领域的重要性[6-8]。

细胞培养室是进行细胞培养、细胞相关研究活动的重要场所，是生物医学工程研究领域科研产出的重要平台。由于细胞培养要求无菌操作，因此细胞培养室的布局及维护管理也就有别于一般的实验室[9]。建设并管理好提供仪器、技术服务的细胞培养实验平台，对于教学和科研的发展有着至关重要的作用[10-11]。本文对平台建设和管理过程中，细胞培养室的布局、仪器管理、制度管理、人员及操作规范化管理进行了探讨，着重分析了新形势下生物医学工程专业研究生细胞培养技术的现状、存在的问题及解决办法，对人才培养及操作规范化管理进行了较为深入的分析。

1 细胞培养实验平台的布局

1.1 细胞培养室设计原则

组织细胞培养技术与其他一般实验技术的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响，便于隔离、操作、灭菌和观察[7]。细胞培养室的总体设计原则是：细胞培养室与其他辅助实验室必须分开；各实验室之间要合理布局，便于实验操作，尽量减少交叉干扰。

1.2 细胞培养室的布局

细胞培养室应配备无菌操作设备、细胞孵育设备、细胞观察设备、细胞冻存设备以及实验用品的准备、清洗、无菌处理等设备[12]。根据各类设备不同功能可将细胞培养室划分为5 个功能区：无菌操作区、孵育区、制备区、储藏区和洗涮消毒区。实验室通常由2个房间组成，无菌实验操作、观察、孵育应安排在同一空间; 而清洗、消毒等操作则安排在另一房间[13]。无菌操作区一般安排在实验室内侧，洗涮灭菌区则设在无菌操作区的对面，准备区和储存区位于两者之间。准备区应靠近洗涮灭菌区，储存区靠近无菌操作区。生物医学工程系细胞培养公共实验平台采用单房间细胞培养室布局设计，如图1 所示。

图1 单房间细胞培养室布局设计

1.3 细胞培养室各区域作用及设计要求

（1）无菌操作区。主要进行细胞培养及无菌操作，理想的无菌操作室应分为更衣间、缓冲间和无菌操作间三个部分。要求地面、天花板及四面墙壁光滑无死角以便清洁和消毒，内壁应当采用塑钢板或瓷砖装修；大小适度，层高不高于2.5 m，以保证紫外线的灭菌效果；配置紫外灯1～2 盏，保持室内无菌状态；安装空气过滤和恒温恒湿装置，恒温温度26 ℃左右；保持正压，尽量减少与外界的空气对流，减少尘埃与微生物侵入；通常由内外间组成，外间为缓冲间，用于准备工作。

（2）孵育区。主要为组织细胞提供适宜的温度、气氛，需保持清洁无尘，应设置在实验人员活动干扰少的区域。

（3）制备区。主要进行细胞培养液和有关培养用的液体等的制备。应设有试剂柜、实验台、上水道和电源等。

（4）储存区。主要存放冰箱、烘箱、液氮罐以及各类实验耗材等，也需保持清洁无尘。

（5）洗涮消毒区。主要进行培养器皿的清洗、灭菌以及细胞培养废液的后续处理等工作。应配有柜子、加热器、高压蒸汽灭菌锅、洗刷器皿、干燥箱、超声波清洗器和水槽等。地面设置地漏并须排水通畅，装修要求耐湿。

2 仪器配备与管理

细胞培养室空间有限，仪器配置应以简单实用为基本原则，根据各个功能区的划分，细胞培养室所配置仪器及管理要求如下。

2.1 无菌操作区

（1）生物安全柜。使用制度：使用遵循预约原则；严格执行生物安全柜的操作规程，摆放废液杯和废品杯各一只；洁净台内也应划分不同的区域，如材料区、操作区、污物区等。

生物安全柜的选用原则：执行标准是欧洲标准EN12469 和美国国家卫生基金会的第 49 号标准（NSF49），根据防护程度的不同，生物安全柜可分为I 级、II 级和III 级三大类，可适用于不同生物安全等级媒质的操作，生物安全柜选用原则见表1。

表1 生物安全柜选用原则

（2）培养箱。每天观察二氧化碳压力表，准备备用钢瓶以便及时换气；定期更换水盘中的水，保证水质清洁无菌；按细胞或人员划分不同区域，按预定位置摆放培养器皿，方便查找；每隔一个月进行一次培养箱高温消毒。

（3）倒置显微镜。使用时应严格遵循设备操作方法，短时不用可将光源调至最弱，避免频繁开关；长时不用，应及时关闭光源，以延长灯泡使用寿命；荧光模块提前5 min 开启预热，开关间隔需大于30 min。

（4）细胞计数设备。一般选用血球计数板，即可满足实验计数所需，而经费充裕的实验室可选购细胞计数仪计数。

2.2 制备区

（1）纯水仪。定期清洗过滤系统、更换滤柱、定期检测水质。

（2）恒温水浴锅。每次用完后，需排干水，洗净并擦干水浴锅内部。

（3）离心机。转速为500～5000 rpm，容量0.5～50 ml，离心前应配平样品。

2.3 储藏区

（1）冰箱及超低温冰箱。按其种类划分不同区域，做好标记并建立台账，定期除霜。

（2）液氮罐。定期检查液氮容量，及时添加液氮；为减少液氮的流失，设定每周固定日期开启液氮罐，存、取细胞株，并做好位置、时间、种类、数量、存放人等相关信息登记。

2.4 洗刷消毒区

（1）高压灭菌锅。属于特种设备，专人专管，操作人员须考取R1 证。灭菌前确认水位处于水位线标记处，排净灭菌器内空气，待灭菌液体为总容量的1/2～3/4，灭菌结束后，排净灭菌器中的水，保持灭菌器无水垢。

（2）鼓风干燥箱。注意温度的设定，塑料器皿应小于60℃。

3 日常管理制度

日常管理制度须涵盖安全、卫生、公共事务等几方面的内容。

3.1 安全管理制度

细胞培养室为相对密闭的空间，安全隐患不容小觑，因此提高学生的安全意识，进行意外事故应急培训并制定相关制度要求至关重要[14]。培养箱配备的二氧化碳钢瓶务必做好固定措施，并定期进行防漏检查。实验室应配备防火安全设施，实验人员应熟练掌握防火安全设施的使用。实验过程中产生的废弃物，按指定要求进行消毒处理后并送往相关回收部门，不应随意遗留在实验平台内[15]。

3.2 卫生管理制度

进入细胞培养室之前首先应保证个人卫生，在缓冲间换上专用实验服及专用拖鞋，戴上帽子和口罩。本细胞培养室专门建立了细胞实验预约平台，按预约原则进入细胞培养室，并且同一时段最多可供4 人预约使用。每周安排1～2 名值日人员，对细胞培养室进行全面的卫生消毒，包括地面、培养箱、显微镜、桌面等各个角落，清洁完后进行抽湿干燥、紫外消毒处理。另外还需清洗细胞培养室专用的实验服和拖鞋。由专职人员每月对二氧化碳培养箱进行一次高温消毒。

3.3 公共事务管理制度

每周值日人员除卫生工作以外还需要完成以下工作：配制消毒用的75%酒精，给细胞培养室内添加足够的95%乙醇供酒精灯使用；处理细胞培养废液、废物；定期查看培养箱内的水量；查看灭菌耗材的储备情况，及时补充；检查公用试剂的储备情况。

4 人才培养及操作规范化管理

4.1 研究生实验技能参差不齐

由于生物医学工程是一门高度综合的交叉学科，所招的研究生来源广，专业分布宽，导致研究生的基本实验技能差异大，给细胞培养技术培训带来一定的难度，如何面向这些不同生源、实验技能差异较大的研究生开展好细胞培养技术培训是目前亟待解决的问题。本细胞培养实验平台准入培训流程如图2 所示。

图2 细胞培养室准入培训流程

4.2 结合多媒体技术进行细胞培养基础理论培训

定期举办细胞培养技术培训，结合多媒体技术，生动展现细胞培养相关信息、技术及安全规范，加强学生对基础理论的理解，提高学生的生物安全意识。

（1）树立无菌观念，提高生物安全意识。离体细胞对病原微生物及病毒无抵抗力，无菌操作是整个细胞体外培养成败的关键，细胞一旦感染，将因被夺营养物质而生长缓慢或停滞，甚至死亡，因此，从接触细胞培养实验开始，就要让学生形成严格的无菌观念。细胞培养废液、废弃耗材的处理需严格遵循《医疗废物管理条例》，防止病原微生物传播，保护环境，保障人体健康[15]。

（2）细胞培养技术理论培训。刚接触细胞培养技术的学生，对细胞培养概念还比较模糊，培训过程中首先利用细胞培养实验教学视频，向学生逐个讲解操作要点和注意事项，目的是让学生充分了解细胞培养所需的常规仪器设备、原理及功能；细胞培养相关试剂的配制（完全培养基、PBS、冻存液等）；原代细胞培养、传代细胞培养、细胞冻存及复苏等实验的原理及注意事项；以及细胞染色、细胞计数等基本实验方法。

（3）细胞培养技术的应用。收集科研团队的细胞实验结果，整理归类，使用多媒体技术，向学生逐一介绍各类细胞实验在生物医学科研实验中的相关应用。细胞培养技术的应用见图3。

图3 细胞培养技术的应用

4.3 实际操作培训

（1）掌握细胞培养室各区域要求。由于细胞培养技术及空间的特殊性，应不急于让学生进入细胞培养室动手实验，而是循序渐进，先了解细胞培养室的各个布局及相关仪器的使用方法，对细胞培养室有个整体而充分的认识，并向学生强调在进行相应的操作时，要严格遵守各区域的操作要求和规章制度。

（2）采用启发式培训模式。培训内容主要包括细胞培养基本技术（原代培养、细胞传代、细胞铺板、细胞冻存、细胞复苏、细胞计数）和观察检测方法（CCK-8 检测、DAPI 染色、Calcein-AM 荧光染色）两个部分。由于参加培训的学生人数较多，难以在短时间内安排所有学生进入培养室进行实验操作，培训采取分批、分组进入进行实验操作。在操作演示过程中，以问题为中心，培养学生的观察与思考能力。采用“一问一答”的方式启发学生多角度思考，设计如细胞培养气氛为5%的CO2的作用，胰酶消化的原理，冻存液中加入DMSO 的作用等提问环节。通过这种启发式的培训模式，能够让学生更好地理解和掌握细胞培养技术的理论知识，引导学生积极分析所观察到的实验现象，激发独立解决问题的愿望，提高学生的实践能力。

4.4 准入考核

所有培训内容结束之后，对学生进行逐一考核，依照考核项目制定考核内容与打分表。细胞培养室准入考核内容见表2，考核分数需达90 分以上，方可进入细胞培养室工作。为尽可能减少人为因素造成的细胞培养室污染，对新进人员设定3 个月实习期，实习期内无安全事故、无污染事故、认真履行职责、服从安排者可获长期使用权限。

表2 细胞培养室准入考核内容

5 结语

细胞培养公共实验平台是进行细胞培养、细胞相关研究活动的重要场所，是生命科学领域科研产出的重要平台，已成为生命科学类院校科研、教学的核心部分。搭建细胞培养实验平台，更为高效、合理地配置相关科研资源，便于科研人员进行学术交流研究，需要全体师生的配合。由于细胞培养要求无菌操作，相比其他实验室，对实验人员的实验技术及操作规范应有更高的要求，只有建立健全规章制度，明确使用权限，完善管理体系，才能保证科研实验顺利进行，使平台运行做到高效、完善和科学化。