棉花不同部位主茎叶对脱叶剂噻苯隆的响应及机理

廖宝鹏，王崧嫚，杜明伟，李芳军，田晓莉，李召虎

（中国农业大学农学院作物化控研究中心/ 植物生长调节剂教育部工程研究中心，北京100193）

棉花属于劳动密集型大田经济作物，特别是在收获环节需要大量的人工投入[1]。 随着社会经济条件的变化，农业劳动力日渐短缺，劳动用工价格提高， 实现棉花机械化收获已成为必然趋势，而化学脱叶是棉花实现机械采收的核心配套技术[2]。

植物激素是调控叶片脱落的主要信号物质。已有研究认为乙烯及生长素是影响植物叶片脱落的关键植物激素[3]，乙烯能诱导纤维素酶等细胞壁水解酶基因的表达从而正向调控植物叶片脱落[4-5]，而离区部位的生长素可以通过钝化离区细胞对乙烯的敏感性来阻止脱落的发生，但这需要生长素源源不断地沿着自上而下（自叶片向叶柄）的方向进行极性运输[6-7]。 脱落酸也可以促进器官脱落，但这种作用是通过抑制生长素的传导或刺激乙烯的产生而间接实现的[8]。

噻苯隆具细胞分裂素活性，属于植物生长调节剂型（即激素活力类）脱叶剂，未发现其对叶片的直接伤害[9]；其作用机理主要是促进叶片产生乙烯，同时抑制叶柄中生长素的极性运输，从而使离区细胞对乙烯更为敏感， 继而诱导叶片脱落[10]。棉花叶片对噻苯隆的响应速度与叶龄有关。研究发现噻苯隆处理棉花叶片后，嫩叶和仍在伸展的叶片快速而完全脱落，而较老的叶片脱落较慢且不完全[11]。 乙烯诱导棉花叶片脱落时也存在类似现象， 即幼叶对乙烯较为敏感容易脱落，老叶则对乙烯的响应比较迟钝，不易脱落[12]。然而至今，不同叶龄叶片脱落的时序性与离层形成的时序性是否一致尚未可知。 此外，虽然有证据表明噻苯隆诱导叶片脱落的关键是刺激叶片产生乙烯，但尚不明确棉花不同叶龄叶片对噻苯隆响应的差异是否与乙烯合成乃至乙烯信号转导直接相关。

因此，本研究通过研究棉花不同叶龄叶片对噻苯隆的响应特征和乙烯合成及信号转导相关基因的表达特征，深入了解噻苯隆诱导棉花叶片脱落的机理，旨在为完善棉花脱叶催熟技术提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料及培养

试验所用棉花品种为欣试17，由河北省棉花种子工程技术研究中心提供。 所用98.3%噻苯隆（Thidiazuron，TDZ） 标准品由德国Dr.Ehrenstorfer 公司生产。

试验于中国农业大学西校区（北京）光照培养室进行，棉花采用营养液培养。 培养室光温条件为14 h（30±2）℃/10 h（22±2）℃，室内相对湿度70%～80%，光照强度为600 μmol·m－2·s－1。浸种前用9%双氧水消毒15 min， 冲洗数遍后置于装有去离子水的烧杯中浸种12 h 以上至露白，播种于沙床中，待子叶完全展开后选取长势一致的幼苗转移至改良Hoagland 营养液中培养。 营养液配方为0.5 mmol·L－1NH4H2PO4，1.25 mmol·L－1K2SO4，2.5 mmol·L－1Ca（NO3）2·4H2O，1.0 mmol·L－1MgSO4·H2O，0.1 mmol·L－1EDTA·FeNa，2×10－2mmol·L－1H3BO3，1×10－3mmol·L－1ZnSO4·7H2O，1×10－3mmol·L－1MnSO4·H2O，2×10－4mmol·L－1CuSO4·5H2O，5×10－6mmol·L－1（NH4）6Mo7O24·4H2O。每3～4 d 更换1 次营养液，通气泵每天24 h 通气。

1.2 棉花不同叶位（叶龄）叶片对TDZ 的响应

棉花培养至10 叶期用4.54 mmol·L－1TDZ均匀涂抹每一片主茎叶，以涂抹清水为对照。 重复3 次，每重复1 株。 每天进行观察拍照，并记录不同叶位叶片离层形成及叶片脱落的顺序。

1.3 乙烯生物合成及信号转导相关基因的表达量测定

棉花培养至10 叶期用4.54 mmol·L－1TDZ均匀涂抹棉花功能叶倒4 叶与幼叶（倒1 叶），以涂抹清水为对照。 在处理后0、3、6、12、24 h 对功能叶及幼叶进行取样，设3 个生物学重复，每个重复为3 株植株的混样。 用北京艾德莱公司生产的EASYspin 植物RNA 快速提取试剂盒提取RNA，Takara 公司的M-MLV 反转录试剂盒合成cDNA。根据NCBI 数据库中GhACS1、GhACO1、GhEIN3 和GhERF 23 基因的CDS 序列设计qRT-PCR （Quantitative real-time polymerase chian reaction）特异性引物（表1），以Ghactin9 基因为内参。qRT-PCR 扩增程序为：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，40 个循环。 采用2－△△CT方法计算基因表达量[13]。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences in this study

1.4 数据处理

用Microsoft Excel 2010 整理数据， 用SPSS 21.0（IBM,USA）对结果进行t 检验（独立样本模型）。

2 结果与分析

2.1 不同叶位（叶龄）叶片对TDZ 的响应

对10 叶期棉花所有主茎叶均匀涂抹4.54 mmol·L－1TDZ 后1 d， 棉株上部叶片与对照相比部分泛黄（图1A）；4 d 后，处理叶片进一步黄化，叶缘卷曲，幼叶已干枯、即将脱落，而对照与处理前相比无明显变化 （图1B）；6 d 后，处理叶片明显干枯泛黄，叶缘严重卷曲，部分叶片叶柄开始变红，叶片脱落，而对照组仍正常生长（图1C）；9 d 后， 可以观察到处理的大部分主茎叶已脱落，而果枝叶未受影响（图1D）。

如图2 所示，4.54 mmol·L－1TDZ 处理棉花主茎叶后，幼叶（倒1 叶）最早形成离层并脱落，其离层形成和脱落时间分别为处理后2 d 和4 d（图2A，2D）；功能叶（倒4 叶）的离层形成时间为处理后6 d（图2B），晚于幼叶和基部叶片（倒9-10叶）， 但离层形成后很快脱落 （处理后7 d，图2E）；基部叶片的离层形成时间居中（处理后4 d，图2F），但其叶片和叶柄于处理后6 d 逐渐泛黄、干枯，出现枯而不落的现象（图2C）。

图1 棉花主茎叶涂抹噻苯隆后的脱落动态Fig. 1 Dynamics of leaf abscission after treated with thidiazuron

图2 涂抹噻苯隆后棉花不同部位主茎叶的离层形成和脱落Fig. 2 Abscission zone formation and defoliationof different main stem leaves after treated with thidiazuron

2.2 TDZ 对不同叶片中与乙烯相关基因表达量的影响

图3 噻苯隆对幼叶和功能叶中GhACS1、GhACO1、GhEIN3 和GhERF23 表达量的影响Fig. 3 Expression of GhACS1, GhACO1,GhEIN3 and GhERF23 in the youngest just expanded leaf and the youngest full-expanded leaf after thidiazuron treatment

本研究检测了棉花幼叶和功能叶 （倒4 叶）中乙烯合成相关基因GhACS1 和GhACO1、乙烯信号转导基因GhEIN3 及乙烯响应元件基因GhERF23 的表达量。 在幼叶中，TDZ 处理后3～24 h 期间GhACS1 的表达量均高于CK， 其中在6 h 和24 h 达到显著水平 （图3A）；GhACO1 和GhEIN3 表达量在处理后12 h 之前与CK 无显著差异，但在处理后24 h 与CK 相比上调数倍（图3C，3E）；GhERF23 基因的表达受TDZ 的显著影响，在处理后24 h 内持续上调，而CK 中该基因的表达量保持稳定，TDZ 处理后3 h GhERF23 的表达量较CK 上调10 倍， 在处理后12～24 h 达40 倍（图3G）。 在功能叶中，TDZ 处理后上述几个基因未出现上调，仅GhACS1 的表达量在处理后12 及24 h 显著高于CK，GhACO1 表达量在TDZ 处理后6 h 显著低于CK（图3B）。

3 讨论

研究表明， 低浓度的乙烯可加速含羞草、番茄等植物较老叶片的脱落[14]。 但用乙烯熏蒸棉株后，顶端未展开或部分展开的幼叶会先于较老的叶片脱落[12]。棉花叶片对脱落剂TDZ 的响应与乙烯类似，通常是刚刚展开的叶片以及顶端还未完全展开的叶片先脱落[10]。本研究结果与此相似。此外，本研究还发现，棉株不同叶位叶片的离层形成顺序与脱落顺序并不一致，主要表现为基部较老叶片的离层形成时间早于功能叶，但其脱落时间晚于功能叶，甚至发生“枯而不落”现象。 细胞壁水解酶是参与植物器官脱落的关键酶[15]，它可使离区中间层的细胞壁发生水解，促使植物器官脱落[16]，其活性受到乙烯的调控[17-18]。 我们推测棉花基部较老叶片经TDZ 处理后， 在前期所产生的乙烯能够诱导细胞壁水解酶合成和分泌，并导致离层形成，但后期乙烯水平可能不足以维持细胞壁水解酶的活性， 因而离层不能继续降解，导致叶片枯而不落。

已知乙烯参与了TDZ 诱导的棉花叶片脱落[11]，乙烯合成抑制剂氨基乙基乙烯基甘氨酸能在一定程度上降低TDZ 的脱叶效果[19]，但是尚不明确乙烯合成及信号转导相关基因是否也参与到该过程。 因此本研究从基因表达水平揭示了棉花不同叶位（叶龄）叶片对TDZ 响应的差异。 1-氨基环丙烷羧酸（1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC）合酶（1-Am-inocyclopropane-1-carboxylate synthase, ACS）和ACC 氧化酶（1 - Aminocyclopropane- 1- carboxylate oxidase,ACO）是催化乙烯生物合成的2 个关键酶，也是番茄和其他物种果实成熟研究的早期靶标[20]。 敲除ACO 和ACS 基因能抑制乙烯的产生从而强烈抑制果实成熟过程[21]。 在乙烯诱导棉花叶片脱落过程中，也伴随着ACC 合酶和ACC 氧化酶活性的增加[22]。 本研究发现，TDZ 处理后，幼叶中GhACS1 基因上调表达的时间早于功能叶；幼叶GhACO1 基因的表达在处理后24 h 显著增加，而功能叶中该基因的表达在处理后24 h 内与CK无显著差异。 结果表明，TDZ 处理后幼叶中乙烯的合成要早于功能叶，这与其较功能叶更早形成离层并脱落相一致。

EIN3/EILs 在乙烯信号转导中发挥着至关重要的作用， 可与下游的乙烯响应因子（Ethylene response factors, ERFs） 基因启动子上特定的DNA 序列结合，诱导ERFs 的表达[23]。 ERFs 是1类具有AP2 结构域的转录因子，受胁迫信号传导途径中的某些组分调节。 用乙烯、脱落酸、盐、冷或干旱胁迫处理棉花，GhERF4 的转录水平大幅度提高[24]。 本研究发现，TDZ 处理后24 h，幼叶中GhEIN3 表达水平较CK 显著增加4 倍，GhERF23 的表达水平在处理后3～24 h 均显著高于CK；而在功能叶中GhEIN3 及GhERF23 的表达量在处理后24 h 之内与CK 相比无显著差异。 显然，乙烯信号转导在TDZ 诱导的棉花叶片脱落过程中也可能起着重要作用。 推测TDZ 首先通过诱导GhACS1 和GhACO1 的表达增加叶片乙烯释放量，然后通过诱导GhEIN3（不排除其他因子） 和GhERF23 的表达向叶柄离层部位传递信号，引起离层部位与脱落相关基因的表达上调，从而促进叶柄离层形成和叶片脱落。

综上可见，棉花幼叶中与乙烯合成和信号转导基因的表达对TDZ 响应较早， 这可能是其经TDZ 处理后脱落较快的重要原因。功能叶中乙烯合成和信号转导基因对TDZ 的响应相对滞后或在24 h 之内未响应，可能是由于该叶位叶片已接近成熟，在基因表达及生理生化水平上对外源刺激有一定的缓冲能力。

近年来国内外对脱叶剂的研究多集中在田间应用方面， 对脱叶剂作用机理的研究相对较少，而深入揭示TDZ 促进棉花叶片脱落的机制是完善机采棉脱叶催熟技术的基础。 后续研究除叶片外要增加叶柄、离层等部位，除乙烯相关基因外要增加生长素合成和信号转导基因，除基因表达水平外还要检测叶片的乙烯释放量和生长素含量，此外要延长检测时间。

4 结论

本研究揭示了棉花不同叶位叶片对噻苯隆（TDZ）响应的差异，基部老叶的离层形成较功能叶较早，但容易枯而不落。 幼叶的离层形成时间和脱落速度快于功能叶及基部叶片，可能与其乙烯合成和信号转导相关基因对TDZ 的响应较早有关。