茵陈苓桂剂对非酒精性脂肪肝病大鼠脂代谢及氧化—抗氧化系统的影响

吴迪 杨晋翔 谢春娥 李峰 李军祥 薛晓轩 王允亮 袁亚利 王乾皓 焦瑶

非酒精性脂肪肝病(non alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指患者在无过量饮酒史的情况下，肝脏出现以肝细胞脂肪变性和炎症反应为主要特征的病理变化，包含多个病变过程，可由单纯性脂肪肝发展为脂肪性肝炎甚至是肝纤维化、肝硬化及肝癌[1]。在世界上，NAFLD的患病率约25%[2]，而目前中国患病率在12.5%～35.4%[3]，引起大家的格外注意。由于NAFLD是多因素所导致的疾病，其发病机制尚未完全明确，目前得到大家广泛认可的是“二次打击学说”，其中氧化应激和脂质过氧化是“第二次打击”的核心机制[4]。治疗上，单种药物治疗机制比较单一，甚至还具有一定的副作用，中药可多方面进行调节，作用于不同的靶点。茵陈苓桂剂以温运清利法为治疗大法，临床研究[5]发现其对痰浊内阻、湿热瘀结者具有很好的治疗效果，因此本研究通过观察不同剂量的茵陈苓桂剂对NAFLD模型大鼠脂代谢、氧化应激指标的影响，探讨茵陈苓桂剂治疗NAFLD的作用机制，为其进一步应用提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与饲料

SPF级雄性SD大鼠60只，体重(200±20)g，均购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0002。高脂饲料配方为：78.8%基础饲料+10%蛋黄粉+10%猪油+1%胆固醇+0.2%胆酸钠，由斯贝福(北京)生物技术有限公司生产，许可证号：SCXK(京)2015-0015。

1.2 主要药物与试剂

茵陈苓桂剂(茵陈18 g、栀子9 g、大黄6 g、茯苓12 g、桂枝9 g、白术6 g、甘草6 g、绞股蓝15 g、水飞蓟12 g)采用中药配方颗粒，购于北京中医药大学东方医院。阳性对照药为：多烯磷脂酰胆碱，赛诺菲安万特(北京)制药有限公司，批号：国药准字H20059010。

血清天门冬氨酸基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)，ELISA测定血清及肝组织丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)试剂盒均购自南京建成。

1.3 主要仪器

Rm-2235石蜡切片机(德国莱卡公司)、OLYMPUS光学显微镜、全自动生化分析仪(日立，7600)、EG1150H包埋机(德国莱卡公司)、酶标仪(Thermo Scientific)、3K18离心机(sigma)、Multiskan MK3等。

1.4 动物分组、造模与给药

60只大鼠适应性喂养1周后，随机分为正常组10只，造模组50只，正常组给予普通饲料喂养，造模组给予高脂饲料建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，所有大鼠均自由摄食、饮水。第8周末，随机处死造模组大鼠2只，取肝组织做病理切片提示造模成功。将造模组大鼠随机分为中药高、中、低剂量组及西药组，每组10只，剩余为模型组。饲养8周后开始药物灌胃干预治疗，给药剂量根据大鼠与人的体表面积等效剂量比值进行折算，中药组给予茵陈苓桂剂，其中低剂量治疗组为4.9 g/kg、中剂量治疗组为9.8 g/kg、高剂量治疗组为19.6 g/kg，西药组予以多烯磷脂酰胆碱0.15 g/kg，正常组和模型组给予等体积的蒸馏水，每日1次，连续4周。

1.5 标本采集与观察指标

末次给药后禁食24小时，次日腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，其中茵陈苓桂剂中剂量组的2只大鼠因不耐受麻醉而死亡。腹主动脉取血，经3000 r/min离心15分钟后，分离出血清，并于-80℃下保存。取出肝脏，将肝组织分出2小块，1块置于4%的多聚甲醛液中固定，另1块-80℃冰冻保存备用。

1.5.1 大鼠一般情况 每天观察并记录大鼠的精神状况、饮食及活动度、毛发光泽度等一般情况，在自由进食和饮水情况下，每周固定称量大鼠体重1次。

1.5.2 检测指标 取肝组织于4%多聚甲醛浸泡固定，常规脱水、透明、包埋、切片，常规HE免疫组织化学染色，在200倍光学显微镜下观察肝组织的病理变化情况，NAFLD活动度积分(NAFLD activity score，NAS)参考《中国非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010年修订版)》[6]。NAS积分(0～8分)：肝细胞脂肪变：0分(<5%)；1分(5%～33%)；2分(34%～66%)；3分(>66%)；数据统计时，百分数四舍五入以整数计算方式。小叶内炎症(20倍镜计数坏死灶)：0分，无；1分(<2个)；2分(2～4个)；3分(>4个)。肝细胞气球样变：0分，无；1分，少见；2分，多见。NAS积分为三者之和，小于3分可排除非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，大于4分则可诊断NASH，3～4分为NASH可能。取离心后的血清，使用全自动生化仪检测大鼠肝酶以及血脂水平，将肝组织匀浆后，按照ELISA试剂盒的说明书测定各组大鼠的血清及肝组织MDA、SOD、GSH-PX的含量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组NAFLD大鼠的一般情况

正常组大鼠进食正常，活动灵敏，毛发有光泽。模型组大鼠精神萎靡、活动迟缓，毛发颜色较深、光泽感较差，饮食正常，排泄正常，体重增长较快。与模型组比较，西药组、中药各剂量组大鼠精神状态、活动量、毛发光泽度及体重增长情况均有所改善。

2.2 各组NAFLD大鼠肝组织病理观察

正常组大鼠肝组织结构、肝小叶、肝细胞未见明显异常；模型组大鼠肝细胞内存在脂肪变、气球样变，胞质内可见圆形空泡，肝小叶结构被破坏、炎细胞浸润、少许点状坏死；中药各剂量组及西药组大鼠肝细胞脂肪变、脂肪空泡、肝小叶结构及炎细胞浸润均较模型组有不同程度的改善，见图1。与正常组相比，模型组大鼠肝组织脂肪变性情况、NAS积分明显升高(P<0.01)；与模型组相比，中药各剂量组和西药组大鼠NAS积分均下降(P<0.05或P<0.01)，见表1。

表1 茵陈苓桂剂对各组大鼠肝组织脂肪变性及NAS的影响

2.3 各组NAFLD大鼠肝酶及脂代谢情况

模型组大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平明显高于正常组(P<0.01)。与模型组比较，西药组与中药高、中剂量组大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平均降低(P<0.05或P<0.01)，中药低剂量组大鼠血清AST、TC显著降低(P<0.05或P<0.01)，见表2。

注：A正常组；B模型组；C中药高剂量组；D中药中剂量组；E中药低剂量组；F西药组

表2 各组NAFLD大鼠血清酶学及血脂水平比较

2.4 各组NAFLD大鼠血清SOD、GSH-PX、MDA的比较

与正常组比较，模型组大鼠血清SOD、GSH-PX水平显著降低(P<0.01)，而MDA水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较，西药组与中药高、低剂量组SOD、GSH-PX均升高(P<0.05，P<0.01)，中药中剂量组GSH-PX显著升高(P<0.01)，中药高剂量组MDA降低(P<0.05)。与西药组比较，中药高剂量组GSH-PX显著升高(P<0.01)，见表3。

表3 各组NAFLD大鼠血清SOD、GSH-PX、MDA水平比较

2.5 各组NAFLD大鼠肝组织SOD、GSH-PX、MDA的比较

与正常组比较，模型组大鼠肝组织SOD、GSH-PX水平降低(P<0.05)，而MDA水平升高(P<0.05)。与模型组比较，西药组与中药高、中、低剂量组GSH-PX均显著升高(P<0.01)，西药组与中药高剂量组SOD水平升高(P<0.01)，而只有中药高剂量组MDA水平降低(P<0.05)。与西药组比较，中药高剂量组GSH-PX水平升高(P<0.05)，见表4。

表4 各组NAFLD大鼠肝组织SOD、GSH-PX、MDA水平比较

3 讨论

人体脂质代谢在肝脏内最为活跃，而脂肪肝是肝脏易发疾病，防治脂肪肝不仅仅对肝脏有益，而且对心血管也极为重要。在发病机制中，氧化应激与脂质过氧化是NAFLD“第二次打击”中主要影响因素，肥胖、代谢紊乱、药物等各种原因导致脂代谢异常，使过多脂质在肝细胞内堆积形成脂肪性病变，在此基础上引起氧化应激，出现脂质过氧化和肝脏抗氧化能力失常。氧化应激过程中可产生更多的活性氧自由基，活性氧自由基对肝细胞膜的脂质及蛋白质进一步氧化，改变肝细胞结构，加重肝细胞的炎症渗出和坏死，使NAFLD进一步恶化[7-8]。

脂质过氧化的最终产物之一是脂质过氧化物(如MDA)，其水平的高低与脂质过氧化程度成正比，MDA可以引起炎症，又可以促进活性氧自由基的形成。在机体抗氧化防御系统中，SOD与GSH-PX具有重要作用，均可有效的分解过氧化物、脂质过氧化物，中止脂质过氧化反应，二者水平的高低代表着机体清除氧自由基的能力[9]。SOD、GSH-PX与MDA在机体内保持平衡，若机体的氧自由基产生和消除失衡，便可导致活性氧在体内蓄积，当MDA异常升高时，便超出了SOD及GSH-PX的清除能力，不能保护肝细胞免受损伤，便发生肝细胞脂质过度氧化，损伤线粒体、溶酶体，最终加重肝细胞脂肪变、炎症坏死，加速了向肝纤维化、肝硬化的转变[10-12]。

中医将NAFLD归属为“癥瘕”“积聚”“肝痞”“胁痛”“痰浊”“肥气”等范畴。其病因病机多与外感寒邪、过食肥甘、劳逸失常，情志失调，肝肾亏虚等有关。根据中医理论，认为本病病位在肝，与脾肾有关，肝失疏泄、脾运化障碍，日久伤肾，导致气血运行受阻、痰湿不化，因此形成病理产物痰、湿、热、瘀相互搏结于肝脏，主要病机关键为痰浊内阻、湿热瘀结[13-14]。茵陈苓桂剂由茵陈蒿、栀子、大黄、茯苓、桂枝、白术、甘草、绞股蓝等组成，方中茵陈蒿清热祛湿、疏肝利胆；茯苓、白术健脾祛湿；绞股蓝、栀子、水飞蓟利湿化痰、清热解毒、疏利肝胆；桂枝温阳化气利水；大黄泻热逐瘀；甘草益气和中、调和诸药。全方既有温补，又有清泄，共凑温化痰浊、清利湿热、祛除瘀结之效，使脾气健旺，肝胆疏泄，气血调畅，阳气得运，化痰湿，祛瘀阻[15-16]。

本研究结果显示，模型组大鼠血清AST、ALT、TC、TG水平较正常组显著升高(P<0.01)，与模型组比较，西药组与中药高、中剂量组大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平均降低，中药低剂量组大鼠血清AST、TC显著降低(P<0.05或P<0.01)。氧化应激指标方面，与正常组比较，模型组大鼠血清、肝组织SOD、GSH-PX水平降低，而MDA水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，西药组与中药中、低剂量组血清与肝组织GSH-PX均升高(P<0.01)，西药组与中药低剂量组血清SOD升高(P<0.05)，而西药组肝组织SOD升高(P<0.01)，中药高剂量组血清、肝组织MDA降低，GSH-PX及SOD水平升高(P<0.05或P<0.01)。与西药组比较，中药高剂量组血清、肝组织GSH-PX显著升高(P<0.01)。肝组织病理结果发现，与模型组相比，各给药组肝组织脂肪变、炎细胞浸润、肝小叶结构均有所改善，NAS积分降低(P<0.05或P<0.01)。

由此可见，茵陈苓桂剂可有效调节NAFLD大鼠的血脂和肝酶，降低大鼠血清、肝组织MDA水平，提高SOD、GSH-PX活性，因此能保护肝功能，调节脂代谢，改善肝脏病理损伤，减少脂质过氧化物的产生，增强抗氧化能力，提示其调节氧化-抗氧化系统的能力可能是茵陈苓桂剂治疗NAFLD的作用机制之一，临床上的治疗效果可能与上述作用有关。