人不同程度疲劳状态唾液蛋白标志物的肽谱研究

许岩丽，肖迪，张慧芳，尹天露，何利华，高晓欢，顾一心，彭贤惠，刘志军，张建中*

本研究价值：

本研究发现人不同程度疲劳状态唾液标志物的肽谱在分子量2 000～15 000 Da范围内有差异峰，为后期进行基于蛋白质组学的疲劳标志物的研究打下了良好的基础。本研究所探索的分子量2 000～15 000 Da范围疲劳相关生物标志物思路，则同时具备了待测物成分稳定、体内干扰因素少和检测体系易于转换和普及的特点，所涉及的疲劳相关生物标志物的探索更具有现实意义和应用前景。后期本课题组将建立疲劳队列，利用目前成熟的生物质谱高通量样品分析技术找到疲劳状态下稳定、特异的生物标志物和生物标志物组合，建立疲劳-相关生物标志物评价模型；相对以往大多数唾液代谢组学研究，蛋白组学结果具有更稳定性优势，进一步研究有望系统建立可用于疲劳识别的唾液标志谱，特别是为进一步实现基于生物传感器技术等的便捷疲劳检测方法提供科学依据，具有重要的理论和现实意义。

疲劳的流行病学研究结果显示：我国每年因疲劳死亡人数多达60万，导致早亡的寿命损失也大于任何一种疾病。疲劳造成的直接、间接总体损失和社会代价巨大［1］，但迄今未能找到便捷的检测方法和手段。虽然许多国家在积极开展职业性疲劳检测的研究工作，西方发达国家也投入了巨大的人力、物力，但疲劳具有渐进性、数据难以客观获得、测量方法和评价指标难以量化等特征［2-3］。在已有的疲劳检测方法研究中，疲劳生理信号的检测虽然灵敏度较高但有侵入性，且需要提取信号粘贴电极；眼动追踪中眼睛闭合占某一特定时间的百分率（PERCLOS）法测量准确率高，对行为特征的检测直观明了，但检测识别的方法复杂，对于瞳孔测量信息提取困难，对视线方向和嘴部状态等的检测受个体、光线和生理状况影响差异较大，可靠性差、抗干扰性也差。最近报道的日本芯片技术、美国的车载模块系统等虽提升了疲劳检测效率，但因设计复杂和性价比等原因，普及性差［4-5］。近期BHATTI等［6-7］通过医生的尿液研究发现，相比于夜间睡觉者，夜间工作（定义为：晚上工作8 h后，在第2天6：00以后换班）者DNA损伤的修复程度非常低，仅是夜间睡觉者的20%左右。但尿液取样不便，且受肾功能及饮水的影响，不适宜代偿性生理指标的检测。到目前为止，比较所有疲劳检测方法，尚无便捷、可靠、无侵入性、性价比也高的检测方法，如果能有一个或一组客观的临床标志物来协助诊断将会具有极为重要的意义，这既是当前国内外研究的热点和难点，也是发展中国家和发达国家共同面临的重大公共卫生问题之一。

其实，疲劳的研究跨越了生理学、分子生物医学、预防医学、计算机技术、影像学等领域，本次研究就是在以往各学科研究基础上，结合了当前实验分析技术的最新发展和实现快速检测的技术需求，选择了临床收集方便和无创的唾液作为检测标本并进行了实验探索［8-10］。相对于有创性的血液检测以及受肾脏等因素影响的尿液检测，由腺体分泌的唾液更具稳定性，且方便取样。目前国内、外开始对唾液成分分析用于疲劳测定的前景给予了高度关注，如日本富山大学和企业合作开发通过检查唾液判定疲劳程度，比测量脑波的方法简便。已有研究显示在疲劳状态下唾液神经节苷脂、皮质醇等小分子可呈现规律变化，但尚难以建立便捷的检测体系，且研究所得指标为小分子物质，较不稳定，不利于后期疲劳检测的推广应用。因此本研究利用目前比较成熟的唾液飞行时间质谱分析技术，探索疲劳状态与非疲劳状态下有差异的大分子量肽段，为研究疲劳更加便捷、稳定的标志物提供重要的理论基础。

1 资料与方法

1.1 纳入标准 正常健康人，签署知情同意书，年龄30～45岁，男女不限，无器质性疾病和慢性疲劳症状；排除标准：（1）持续或反复发作的疲劳持续6个月以上；（2）咽喉疼痛；（3）颈部或腋下淋巴结肿痛；（4）肌肉疼痛；（5）多发性非关节炎性疼痛；（6）头疼；（7）睡眠障碍；（8）劳累后不适持续24 h以上；（9）口腔疾病；（10）近3个月内服用药物及膳食营养补充剂；（11）吸烟和近1周内接受过补牙治疗。

1.2 一般资料 符合纳入标准的正常健康志愿者10人，年龄30～45岁，性别：男5人，女5人。自愿参加本项研究并签署知情同意书，收集唾液样本时间为2013年4月10—12日。本研究已经过河北工程大学附属医院伦理委员会批准（日期：2013-03-12）。本研究临床试验注册号：ChiCTR-DCD-14005746。

1.3 唾液样本采集 （1）唾液标本取样：使用唾液收 集 管（ISO9001 certified.CRYO.STM Greiner Bio-One GmbH.Maybachstr.2.72636 Frickenhausen.Gemany E-mail：info@de.gbo.com www.gbo.com/bioscience），医生分别于接班前（工作前）和长时间（≥18 h）工作后采样。采样前用蒸馏水漱口消除残留物，再用0.9%氯化钠溶液漱口3次，1 min/次，结束后静坐5 min；采样时志愿者坐在镜子前，保持垂直坐位，头稍向前倾并保持眼睛张开状态，然后做咀嚼运动以刺激唾液的分泌，当有一定量的唾液积聚在下颌部后，舌抵上颚，张口，舌头自然翘起，下嘴唇唑成一个“V”型，使唾液自然流入事先准备好的唾液收集管中；收集2 ml唾液，并记录实验时采样与进食的时间间隔及食谱特征。（2）唾液标本储存：由科研助手进行记号标记，-70 ℃冰箱保存。（3）唾液标本检测：由中国疾病与预防控制中心传染病预防控制所国家重点实验室（MALDI-TOF MS）完成检测。

1.4 脑电图检测与数据采集 在长时间（≥18 h）工作后采集脑电图，检测是否出现疲劳波（慢波增加，快波降低，即delta波和the 波alpha波和 beta波数量进行比对）。出现疲劳波，立即采集唾液。脑电图采集使用SOLAR太阳电子科技有限公司脑功能监护系统公司生产的SOLAR-RTA 、SOLAR-BFM脑功能监护系统，并进行脑电功能实时分析、脑功能综合分析。

1.5 唾液蛋白标志物肽谱分析 试剂和仪器：WCX磁珠试剂盒：Bruker公司。α-氰基-4-羟基肉桂酸〔α-Cyano-4-hvdroxycinnamicacid（HCCA）〕：Bruker公司，质量浓度0.3 g/L；乙醇（色谱级）/丙酮（色谱级）=2/1，新鲜配制。AutoFlexIII型MALDI-TOF质谱仪：Bruker公司。WCX磁珠处理过程：从4 ℃冰箱取出WCX磁珠试剂盒，处理过程参照试剂盒说明书，主要经混匀、清洗及洗脱等步骤。最后将洗脱的多肽样品溶液移入干净的0.5 ml样品管中，备质谱分析。 点样及质谱分析：将磁珠分选后的多肽样品溶液及唾液原液各取1 μl分别点靶，室温下干燥后再各加入1 μl浓度为3 g/L的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液（溶于50%乙腈，2%三氟乙酸）；将制备好的点样板置于MALDI-TOF质谱仪上进行分析；应用线性模式，采集分子量范围为1 000～10 000 Da，激光能量为20%，累计400 shots；质谱信号单次分别以磁珠富集（MB）的唾液和离心后直接取上清液（原液）的唾液进行质谱分析；扫描累加50次，获得肽质量指纹图（PMF）。

质量控制：试验前对课题组成员进行相关培训。详细告知志愿者试验情况，发志愿者胸卡，设立唾液收集指导和监督，每一位进行唾液采样的人员需要接受严格的统一的采唾液训练，志愿者能够自己采集样本，脑电图和睡眠剥夺监督由专人负责。

1.6 统计学方法 采集分子量范围为1～15 000 Da，选择标准品进行分子量校正。模型建立及盲筛试验：使用Bruker公司提供的Clin Pro Tools（3.3.0版本）软件（遗传算法）建立模型并验证。

2 结果

2.1 通过对10人份合格的志愿者唾液样本（晨起，漱口后分泌；下午下班前漱口后分泌）采用WCX MB和原液直接检测两种样品处理方式进行飞行时间质谱分析，获得如下实验结果：磁珠和直接采样均在2 000～15 000 Da之间具有很好的谱图，富集会丢失部分峰。每个人早、晚的谱图均有差异，由于样本份数有限，暂未行交叉验证，因此每个样本采两张谱图，早晚各用20张谱图建模分析：在原液样本两组间发现有3个差异肽（见图1～8）。

2.2 模型识别 分别以MB的唾液质谱和原液的唾液质谱建模，其建模分布见图8，MB模型的交叉效度为92.06%，原液模型的交叉效度为95.49%（见表1）。

图1 原液检测：在超过15 000 Da区域几乎没有检测峰Figure 1 Raw liquid detection：there is almost no detection peak in the area over 15 000 Da

图2 不同个体样品间存在共同的肽峰Figure 2 Common peptide peaks exist among different individual samples

3 讨论

图3 个体1早晚样品图谱比对Figure 3 Comparison of sample Atlas of individual 1 in the morning and evening

精神和躯体疲劳会导致操作人员由适任状态衰退成亚适任和不适任状态，类似醉酒后失去正常活动或工作的能力，是各国面临的重大公共卫生问题之一。全球每年因疲劳导致的伤害占职业性伤害的21.7%，所致死亡占交通死亡的57.0%；但迄今未建立类似酒驾检测的无创、便捷的疲劳检测技术。澳大利亚悉尼大学健康研究中心利用人工神经网络对采集的脑电图信号进行处理，发现疲劳时Theta波明显增加，这为检测疲劳提供了依据，一直被誉为检测疲劳的金标准，可作为诊断性试验的参考，但其提取信号必须用接触人体的电极［11］。虽然FUKUDA等［12］制定的诊断疲劳标准被国际医学界公认为金标准，但涉及脑电图Theta波、心电图高频（HF）及低频（LF）/HF的比率变化等［13-15］。以往研究疲劳诊断装置多集中在驾驶防瞌睡装置［16］、眼动测量系统［17］、机动车驾驶员疲劳测评方法［18］、TI公司高速图像处理芯片TMS320DM642的疲劳检测预警系统等方面，但是成本较高价格昂贵，推广普及的局限性大。本研究应用飞行时间质谱仪对多个个体不同疲劳状态下唾液样品行质谱分析，发现谱图有显著差异，磁珠和直接采样均在2 000～15 000 Da内获得良好谱图，在组间发现3个差异肽，唾液肽谱随着疲劳的出现表现出明显的变化并呈现一定的规律性，此结果强烈支持通过唾液标志肽分析进行疲劳识别具有可行性。本研究分别以MB的唾液质谱和原液的唾液质谱建模，结果MB模型的交叉效度为92.06%，原液模型的交叉效度为95.49%，而二者可接受度均为100%。

图5 个体3早晚样品图谱比对Figure 5 Comparison of sample Atlas of individual 3 in the morning and evening

图6 个体4早晚样品图谱比对Figure 6 Comparison of sample Atlas of individual 4 in the morning and evening

图7 MB（磁珠富集）与原液（离心后直接取上清液）唾液质谱图Figure 7 MB （magnetic bead enrichment） and the saliva mass spectrogram of the original liquid （after centrifugation）

图8 两种建模的分布Figure 8 The distribution of two kinds of modeling

表1 两组模型的基本信息及交叉效度与可接受度（%）Table 1 The basic information and cross validity and acceptability of the two groups of models

国外唾液蛋白质组学研究已经引起广泛关注［19］，目前其已经运用蛋白质组学技术从正常人的全唾液中成功鉴定出309种蛋白。通过对发现的309种唾液中蛋白的功能分类，发现最多的还是功能未知的蛋白（占28.7%），而免疫相关的蛋白占21%，其中同蛋白复制和修复相关的蛋白占1.6%，细胞动力和分泌相关蛋白的占4.8%，转录和核糖相关的蛋白占2.3%，细胞繁殖和细胞循环相关的蛋白占4.2%，信号传导蛋白占9.7%，代谢相关蛋白占5.2%，细胞骨架及内膜相关蛋白占7.1%。作为一种成分复杂、具有多种生物学功能的重要体液，唾液中独特、丰富的蛋白质成分毫无疑问是潜在的肿瘤及其他疾病理想的生物标志物。长期以来，原有的技术限制了口腔唾液蛋白的通量分析和精确测定，致使大多数唾液蛋白的生物功能处于未知状态，唾液在人体疾病诊断和预后判断中的潜在作用并未显现。高通量、高精度的蛋白质组学技术的应用使得从唾液蛋白中标记用于疾病的早期诊断或预防、生物蛋白靶向治疗、预后监测判断等的肽段成为可能［20］，而这也是本研究选用唾液的理论基础。

疲劳是复杂的生化过程，单一生化指标无法准确地判断机体是否疲劳。唾液的蛋白组学研究为通过唾液检测疲劳提供了新的研究方向。唾液中含有多种生物活性成分，包含部分可用于疾病诊断的生物标志物。相比于血液和尿液，唾液的收集过程更为简便且其收集过程具有完全无创的优点。唾液代替血液、尿液在无创疾病诊断中的作用已日益显现。已有研究显示在疲劳状态下唾液神经节苷脂（分子量为1 563.85 Da）、皮质醇（362.47 Da）等小分子可呈现有规律变化，但尚难以建立便捷的检测体系。国内、外开始对唾液成分分析用于疲劳测定的前景给予了高度关注，如日本富山大学和企业合作开发通过检查唾液判定疲劳程度，较测量脑电波的方法更简便。

疲劳的发生机制比较复杂，既往研究认为其是多种感染、应激等引起神经-内分泌-免疫网络功能紊乱的结果，近期研究进一步发现遗传、代谢等方面的因素也可能参与其中，也有多项研究对长时间运动期间血液化学成分的变化进行了调查，但因其确切的病因未明及其生物标志物分子用作诊断、预防、治疗指标的金标准尚未找到，因此目前尚没有被普遍认可的疲劳程度客观评估标准，一个理想的疲劳程度评估标准应当可用于实时无创性评估，并具有高灵敏度和高稳定性，像快速识别检测酒驾一样，才能有效预防和减少因疲劳导致的生命和安全隐患。唾液可以非侵入方式方便获得，目前国内外针对唾液成分变化的研究较少，大部分集中在运动员和士兵唾液代谢产物浓度变化及代谢组学研究，而且在医疗领域，疲劳的研究还是一个被边缘化的问题［21］，研究主要集中在对分子量低于1 000 Da的小分子物质的分析［22-25］。以往研究结果发现的与疲劳相关的指标有皮质醇、睾丸素、脱氢表雄酮等，均为小分子物质，较不稳定，不利于后期疲劳检测的推广应用。KUME等［26］通过大鼠建立疲劳模型，发现与限食组的大鼠相比，疲劳组大鼠的缬氨酸（分子量为117.15 Da）、亮氨酸（131.18 Da）和异亮氨酸（131.17 Da）显著增加，瓜氨酸和羟脯氨酸含量显著降低；疲劳组大鼠血浆总一氧化氮水平升高，提示全身氧化应激；此外，疲劳组大鼠血浆代谢产物参与柠檬酸循环，如顺乌头酸、异柠檬酸降低。有研究利用数理模型分析从数十种代谢产物中筛出慢性疲劳综合征组和健康对照组有差异的指标如cisaconitate、socitrate、citrate、malate［27］。RA 等［28］通过代谢组学分析发现，连续进行 3 d的足球比赛后运动员唾液中存在可以作为疲劳标志物的代谢产物，即3-甲基组氨酸（3M-His）、葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）、葡萄糖-6-磷酸（G-6-P），以及一些氨基酸类化合物，但其未对这些标志物的诊断效能进行分析。KATAOKA等［24］用自动在线管内固相微萃取（SPME）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）同时测定唾液中睾酮、皮质醇、脱氢表雄酮，发现对40 μl样品进行处理，SPME与LC-MS/MS方法具有良好的线性关系（r≥0.999 8）、精密度（日内和日间精密度分别为4.9%和8.5%）和检测灵敏度（定量限分别为约0.01、0.03和0.29 ng/ml唾液），同时用这种方法对压力和疲劳状态下唾液中的睾酮、皮质醇和脱氢表雄酮的水平变化进行分析，显示了质谱技术的测定优势。

小分子激素类或代谢产物类物质的变化虽可能与疲劳有一定关联性，但易受到饮食和其他健康状况的影响；同时这些小分子标志物常不具有良好的抗原性，不易将精密仪器分析发现的生物标志物改用免疫学或生物传感器等简便方法进行测定。本研究应用飞行时间质谱仪对多个个体不同疲劳状态下唾液样品行质谱分析，发现谱图有显著差异，磁珠和直接采样均在2 000～15 000 Da内获得良好谱图，并在组间发现3个差异肽，唾液肽谱随着疲劳的出现表现出明显的变化并呈现一定的规律性，此结果强烈支持通过唾液标志肽分析进行疲劳识别具有可行性。本研究所得出的蛋白标志物分子量范围为后期找到大分子量的蛋白质组打下了良好基础，且因大分子量指标更稳定，为后期找到类似于酒驾检测标志物的疲劳检测指标提供了理论基础。

据《日本经济新闻》报道［29］，人在感到疲劳时，血液中的特殊激素糖皮质素的含量就会增加，因此唾液里会分泌出α-淀粉酶，而被称为“心仪”的仪器装有一个芯片，可通过将人的唾液放在芯片上，再将芯片粘贴到仪器上来检测疲劳程度。MICHAEL等［30］研究的唾液样本来自于9名在休养训练期间参与一项旨在模拟长时间体力劳动、军事行动和火灾救援工作的交叉研究的自行车手，结果表明：参试者疲劳生物标志物指数（FBI）值的分布差异度随着体力活动时间的延长而减小。自我报告的疲劳程度与参与者脑脊液（CFS）和健康对照血清瘦素（16 000 Da）水平呈显著正相关，支持主要假设；机器学习算法区分高在CFS组78.3%精度低疲劳的日子［31］。相关研究通过探讨不同指标对高强度间歇训练时疲劳和恢复的常规评估的变化发现肌酸激酶（42 000 Da）在疲劳及恢复期的变化差异有统计学意义［32］。本研究结果从侧面证实了以上研究结果的正确性。

作者贡献：许岩丽、张建中进行文章构思与设计；肖迪、张慧芳负责关键技术和肽谱分析；何利华、顾一心、彭贤惠进行实验室操作、唾液样品前期处理、实验数据收集；尹天露、高晓欢负责资料汇总、数据处理、论文撰写及修订；张建中、刘志军负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理。

本文无利益冲突。