紫外诱变富集培养获得那西肽高产菌株试验

张善飞 王振华 梁景乐

（山东胜利生物工程有限公司 272000）

那西肽是活跃链霉菌（Streptomyces actuosus）产生的次级代谢产物,与硫链丝菌素(Thiostrepton)、盐屋霉素(Siomycin)及硫肽霉素(Thiopeptin) 等抗生素结构相似,均属于含硫多肽类抗生素[1]。紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素。紫外线辐射能引起DNA 链的断裂、DNA 分子内和分子间的交联等,但最主要的是使双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体,阻碍正常配对,从而引起突变[2]。富集培养亦称增殖培养、加富培养,是指利用不同微生物间生命活动特点的不同,人为地提供一些特定的环境条件,使其按照预定的方向生长[3]。通过前人的研究发现,那西肽的骨架是由各种氨基酸构成的,并且现在也基本摸清了那西肽的合成途径[4],因此,通过氨基酸富集来提高那西肽的生产水平很有必要。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

那西肽产生菌：活跃链霉菌Streptomyces actuosus SL2020012,保存于胜利生物菌种中心。

1.1.2 培养基

基本斜面培养基：可溶性淀粉20g,硝酸钾1g,磷酸氢二钾0.5g,硫酸镁0.5g,氯化钠0.5g,硫酸亚铁0.01g,琼脂20g,pH7.5,加水至1000ml,分装完毕后121℃,灭菌20min,平铺待用。

种子培养基：葡萄糖30g,玉米浆20g,氯化钠1g,硫酸铵5g,pH7.0,定容1L。

发酵培养基：淀粉50g,葡萄糖20g,黄豆粉10g,硫酸铵5g,轻质碳酸钙3g,pH7.2,定容1L。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备

用生理盐水30ml 加入斜面试管,轻轻刮下孢子,移入装有20ml0.05%Tween80 溶液和玻璃珠（15 个）的150ml 三角瓶中,振荡15min 后,用过滤装置（无菌滤纸+漏斗+50ml 三角瓶）收集滤液。

1.2.2 紫外诱变

提前30min 打开紫外灯,将5ml 孢子悬液置于灭过菌的4.5ml 的培养皿中,放置在磁力搅拌器上,开启磁力搅拌器,打开皿盖,边照射边搅拌,并计时,照射时间分别为0、30、60、90、120s,计算致死率。

1.2.3 氨基酸富集培养

将紫外诱变处理后的单孢子溶液涂布于各种0.1%氨基酸（色氨酸、苏氨酸、半胱氨酸）的斜面培养基上,28℃,培养168h,筛选高产变株。

1.2.4 高产菌株验证

将筛选好的高产菌株,斜面培养成熟后,接种子瓶,转发酵瓶,28℃培养168h,测定那西肽含量,那西肽含量利用HPLC 进行检测[5]。

2 结果

2.1 紫外线照射时间对出发菌株致死率的影响

由表1 可知,活跃链霉菌经过紫外线照射,致死率随着UV 照射时间的增加而提高。在0～110s 的UV 照射下,菌株的致死率为0%～100%。其中UV 诱变处理90s 时,平板上的存活的单菌落为61 个,与对照组（115 个菌落）相比,90s 时的致死率与以往前人所得的结论致死率在70%～85%的一致,所以该菌株最适的处理时间为90s。

表1 UV 照射时间对出发菌株致死率的影响

2.2 氨基酸富集培养后单菌情况

将诱变处理的孢子液涂布于含有氨基酸的平板,情况如表2。由表2 可知,3 种氨基酸对活跃链霉素的数量基本没有太大影响,但对单菌大小影响较大。半胱氨酸单菌大小较对照提高10%。

表2 UV 诱变的氨基酸富集培养情况

2.3 高产菌株验证情况

表3 高产菌株验证情况

由表3 可知,对于效价半胱氨酸效果最好,提高24%。色氨酸提高10%,而苏氨酸却降低6%。

3 讨论

本试验利用紫外诱变和氨基酸富集培养能有效筛选出那西肽高产菌株。主要原因可能为那西肽的结构是由氨基酸组成,另外,合成途径中半胱氨酸是转化为噻唑环的前体,而噻唑环是那西肽的重要组成部分。综上,紫外诱变富集培养是获得那西肽高产菌株的有效方法。