不同浓度C3H8O3、VE 猪精冷冻液保存效果分析

潘懿 李军华

（1，广西百色市畜禽品种改良技术推广站 533000；2，广西田林县旧州镇水产畜牧兽医站 533308）

自我国发生非洲猪瘟疫情来,生猪产能下滑,如何提高能繁母猪产能问题尤为突出,而要保持能繁母猪产能需要数量充足优质的猪精液作为后援。当前全国优质猪精液数量有限且分布不均,提高优质猪精液利用率显得十分重要,延长精液保存时间是提高优质猪高效精液利用率的前提。为此,笔者在基础液中添加不同浓度的C3H8O3、VE及6%C3H8O3+VE组合配制成冷冻保存液,探索在超低温环境下保存精液最佳的配方,提高猪精液利用率,推动生猪产能平稳发展。

1 材料与方法

1.1 保存液及冷冻液的配制

1.1.1 A 液配方

采用《猪精液质量评定规范》的BTS 配方。B 液配方：D-葡糖11.15g,其他与A 液相同。

1.1.2 C3H8O3冷冻保存液配制

在A 液分别加入C3H8O3,调至最终浓度（V/V）分别为：0%、2%、4%、6%、8%冷冻保存液。

1.1.3 VE冷冻保存液配制

在A 液分别加入分别添加VE,调至最终浓度为0、0.25、0.50、0.75、1.0mg/ml 冷冻保存液。

1.1.4 6%C3H8O3+不同浓度VE冷冻保存液配制

在B 液加入C3H8O3（V/V）6%,再添加VE,调至最终浓度为0、0.25、0.50、0.75、1.0mg/ml VE的冷冻保存液。

1.2 精液采集和处理

1.2.1 猪精采集

采自3 岁种公猪,临床检疫健康。精液物理性状正常。精子活率60%以上。

1.2.2 精液处理

洗涤去浆：将精液室温静置30s,按1：5 加入基础液A 常温200rpm 离心5min,除去上清液得到高浓度的精液,进入冷冻预处理环节。

1.3 试验方法及检测步骤

1.3.1 冷冻液配制

用B 液配制6%C3H8O3+VE冷冻保存液冷冻保存效果试验。先配制6%C3H8O3,再添加VE,调至5 个浓度冷冻保存液,分别混入精液,调整精子最终浓度致1.0 亿/ml,再进行冷冻前预处理环节。

1.3.2 冷冻前预处理

将配制好的精液保存液放置15℃平衡60min,摇匀用0.25ml 的聚乙烯细管分装封口置4℃的冰箱120min。

1.3.3 精液冷冻

将精管快速浸入距液氮面下7.5cm (-20℃) 平衡30s,再迅速下降至距液氮面下10cm (-80℃) 平衡1min[1],最后于液氮中下部保存,30d 后解冻进行检测。

1.3.4 精液解冻

将精管取出在空中轻摇2s,放入37℃水浴轻摇30s[2],取出擦干剪封口在37℃恒温检查,并做好记录。

1.3.5 解冻后精子质量测定

利用RCZ-200G 型精子自动分析仪设定被检精子总数200个为基数自动检测精子活率、活力、畸形率,评估各组冷冻液冷冻保存效果。

1.3.6 精子顶体检测

快速改良巴氏染色,相差显微镜1000×下随机观察200 个精子,计算顶体完整率。

1.4 数据处理

试验结果用“平均数±标准误” 表示,用SPSS 进行方差分析[3]。

2 结果

各组冷冻保存液在超低温(液氮) 中保存精液质量统计结果,见表1～3。

3 结论与讨论

3.1 添加浓度（V/V）为6%C3H8O3 保存液对猪精液质量保护效果最明显

由以上结果可知,C3H8O3浓度（V/V）为6%、8%保存液解冻后精子的活力、活率、畸形率及顶体完整率与0%C3H8O3（对照组）差异显著(＜0.05)）,添加浓度为6%C3H8O3整体保护水平优于8%,但差异不显(＞0.05)。表2 添加浓度0.25mg/ml VE 冻保存精液质量效果好。添加量为0.25mg/ml VE精子的活力、活率均高于其他组,但组间差异性不显著(＞0.05),与对照组差异显著(＜0.05)；0.5mg/ml VE组精子畸形率最低,与对照组、1mg/ml VE组差异显著(＜0.05)；0.5mg/ml VE组对精子顶体保护最佳,与对照组差异极显著(＜0.01),各试验组间畸形率、顶体完整率差异不显著(＞0.05)。表3 表明,6%C3H8O3+0.25mg/ml VE组保存精液质量效果最好。从试验结果得出,6%C3H8O3+0.25mg/ml VE组对精子保存的活率、活力均优于其他试验组,但试验组间差异不显著（＞0.05）。

表1 A 液+C3H8O3 保存精液质量统计表

表2 A 液+VE 保存精液质量统计表

表3 B 液+6%C3H8O3+VE 组合保存精液质量统计表

3.2 6%C3H8O3+0.25mg/ml VE 保存效果最好，是超低温冷冻保存首选配方

将3 个结果比对可知,6%C3H8O3+0.25mg/ml VE组各项指标均优于其他试验组,除与表2 的0.25mg/ml VE组的精子活率差异显著 (＜0.05),与其他试验项目差异不显著 （＞0.05）。C3H8O3和VE混合使用保存效果比单独使用效果好,但效果未呈现叠现象。表3 与表2 添加VE同浓度保存效果进行比对,表3 冷冻保存效果优于表2,但保存效果未出现叠加。

3.3 精液冷冻过程采用分步降温平衡，减少精子的损伤

冷冻速度可直接影响冷冻保存效果,冷冻速度过快则可能出现水分留滞在精子内,降温时结成结冰晶对细胞造成物理或化学损伤,过慢则可能细胞过度脱水,也会导致物理损伤。本试验冷冻过程遵守单向降温原则,3 步法控制冷冻速度,尽量减少影响精液冷冻保存效果。据张渭斌等指出,冷冻精液高危险温区为0～60℃[4]。有研究指出,冰晶形成的损伤取决于冰晶大小、数量和位置[5],精液冷冻保存过程应选择合适的降温速度。

3.4 加大探索精液低温冷冻保存技术解冻过程中损伤精子机理及解决技术方案

目前的研究多数围绕精液冷冻保存过程对精子造成的物理、化学及氧化损伤,对解冻带来的损伤机理及解决方案研究相对少,建议加大这方面的研究。据梁鸿斌等研究发现,精子解冻过程要经历两次临界温度区（-60℃和-15℃）,不同解冻方法对精液品质的影响大[6]。选择适当的解冻温度及解冻速度,使玻璃化快速越过结晶态而直接变为液态,可减少对精子的伤害[7]。

3.5 适当浓度的C3H8O3 可增强精子的抗冻能力

目前,可选择的抗冻保存剂种类和品种较多,常见渗透性防冻剂有DMSO、C2H6O2及C3H8O3。本次试验选择使用C3H8O3原因有：首先C3H8O3分子与水分子有亲和力,可通过氢和离子键与细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分构型,其次C3H8O3毒性较小,最后C3H8O3容易获得且物美价廉。本次试验结果表明,C3H8O3超低温保存猪精液保存效果最佳使用浓度为6%（V/V）。刘晓宁等认为,C3H8O3对不同物种的精子最佳保存浓度不尽相同[8]。另外,有研究发现,精液低温冷冻保存添加剂添加最佳浓度具有多个浓度[9]。

3.6 VE 生物活性能提高精液超低温冷冻保存质量

VE具有活跃的生物活性。首先VE极易发生氧化,特别喜好与超氧阴离子() 和羟基自由基(OH-）发生反应；其次对某些酶的活性具有保存功能。特别对细胞膜、线粒体或网状组织等的磷脂有特殊的亲和性,可使精子含磷脂组织或结构免受ROS 攻击,减少精子膜发生氧化反应概率,同时保存巯基不易被氧化间接保存多种酶的活性,从而提高精子在超低温状态下延长寿命。本次试验试验结果表明,在超低温保存液中添加VE可提高精液抗冻水平,添加量为0.25mg/ml 时综合保护水平最佳。

3.7 C3H8O3 与VE 混合添加，增强了精液保护质量

本次试验得出6%C3H8O3+0.25mg/ml VE组各项指标均优于其他试验组,随C3H8O3、VE添加浓度的提高,保护水平呈先升后降的趋势。出现这现象原因可能是随C3H8O3、VE添加浓度（量）的升高,保存液渗透压随之升高,峰值后冷冻保存液渗透压高于精液子能承受最高渗透压造成的精子损伤。因此,在以后的研究中仍需加强研究各种畜禽精子承受液体渗透压极限数据,优化冷冻保存液配方,提高超低温冷冻精液的质量。