高通量测序法对苯胺类染化废水中微生物菌群多样性的试验研究

董焕成，买文宁,吕志栓

（1.喀什大学土木工程学院，喀什844000；2.郑州大学生态与环境学院,河南郑州450001）

苯胺能够和血红蛋白相结合生成高铁红蛋白，从而可使血红蛋白和氧的结合力降低，导致动物出现中毒的现象，对生物体造成严重程度上的危害[1]。苯胺是一种严重污染环境以及危害人体生命健康的有害物质，有一定的致癌性[2]。印染，塑料，农药，医药等工业生产的废水都含有较高浓度的苯胺[3]。苯胺类染化废水一般呈黄棕色，如果不经处理直接排入水体中，会对水体环境造成污染，进而危害到人类的健康。

高通量测序技术，也称深度测序、“下一代”测序技术，一次能够对几十万条乃至上百万的DNA分子来进行测定，并且其一般读长比较短，另外能够对一个物种的基因组及转录组进行细致地全貌分析[4,5]。而且高通量测序直接对微生物进行测定，不需要进行培养，能够更加客观地反映微生物菌群的多样性[6]。本试验通过用高通量测序法对反应进程中活性污泥微生物菌群多样性的变化进行研究，探讨苯胺类染化废水对活性污泥中微生物群落的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验用水取自新乡某染化公司，其COD 为30000mg/L，BOD5为12000mg/L，NH3-N 为12.16mg/L，SO42-为70480mg/L，SS 为600mg/L，pH 为11.03，含盐量为17%。实验所接种的好氧污泥TS 为5.81 g/L，VS/TS 为54.47%。

1.2 实验装置

试验所用总体积为9L 的反应器，其有效容积6 L。进水采用瞬时进水法、排水采用虹吸排水法。反应过程中通过内置曝气头进行曝气。

1.3 实验方法

在反应器内通入4L 实验用水、2L 好氧污泥，使其充分混合接触，温度为室温，pH 值控制在7.5左右，每天定时取样测定其COD 值，当随着每次进水后COD 值达到不变时，可看作一个运行周期。试验所用的污泥样品分别于第0、3、6 周期取样，并分别编号1 号、2 号、3 号。对3 个样品委托上海生工生物有限公司进行高通量测序，对微生物菌群多样性的变化进行分析。

2 结果与讨论

2.1 OTU 分析

对3 个污泥样品进行高通量测序，测序结果如表1 显示序列长度大部分分布在400～600bp 之间，平均长度为440bp，可以看出测序结果比较好。为提高后续的质量分析和数据可靠性，对原始序列进行去接头、质量剪切等处理[7]。在过滤低质量以及短长度序列之后，反应初期污泥样品中有36461 个序列，其平均长度415。中期有36907 个序列，其平均长度410。后期有47661 个序列，其平均长度408。后经去嵌合体及靶外序列，初期有31874 个序列，中期有25031 个序列，后期有26253个序列。共获83158 条，并聚类于12356 个OTU。

表1 3 个污泥样品的高通量测序数据

通过图1 统计三个样品中共有和独有的OTU数目，直观展现出活性污泥中微生物多样性和丰度，由图1 可以看出，反应三个阶段的OTU 数目分别为8303、2115 和1938 个，其中三个污泥样品的共有OTU 数为112，特有OTU 数分别为7888、1325 和1305。反应初期和中期污泥样品的共有OTU 数为342，反应初期和后期污泥样品的共有OTU 数为185，反应中期和后期污泥样品的共有OTU 数为560。

图1 VENN 图

2.2 α-多样性分析

三个样品的微生物菌群通过α-多样性分析的各项指标如表2 所示。由表2 可得，在97%的分类水平上，覆盖率值均>83%，能够真实地反映污泥样品中微生物群落的信息。反应初期的Shannon 指数7.50 比中期4.76 和后期4.96 大，Chao1 指数19705 比中期5517 和后期4348 大，ACE 指数32516 比中期8029 和后期6551 大，而Simpson 指数0.0042 比中期0.0421 和后期0.0324小，因此反应初期的微生物菌群多样性与中后期不同，其复杂程度随着反应进程明显降低，也说明微生物菌群多样性在逐渐减少。

2.3 Beta 多样性分析

Beta 多样性分析结果显示样品之间微生物菌群的相似度[8]。对三组样品进行样本聚类分析，结果显示反应中、后期污泥中微生物菌群组成的相似度可达88.75%，与反应初期相比差异较大。由图2 和图3 中同样可得，反应中、后期在图中较为聚集，表明其相似度较高。而反应前期距离中、后期均较远，表明其相似度较低。

表2 3 组污泥样品的α-多样性指数

图2 样本聚类图

图3 PCoA 分析（2dplot）

3 结论

本试验以苯胺类染化废水为研究对象，通过高通量测序法对微生物菌群的多样性进行OTU分析、Alpha 多样性分析、Beta 多样性分析。结果表明，通过利用苯胺类染化废水对活性污泥进行驯化，微生物菌群多样性在不断减少，随着反应周期的增加，微生物组成的差异性不断降低，污泥中细菌群落变化较为显著，即可能会促进某些微生物菌群的增长繁殖，同时也可能抑制部分细菌生长。