复方芙蓉花叶提取物体外抑菌作用研究*

张 容，杨 芳，李益麟，李春花，梁 志，刘少琼

（南华大学附属第一医院肛肠科，湖南 衡阳 421000）

中医理论认为，肛门手术损伤致局部气血瘀滞，经脉阻塞，不通则痛，创面失于濡养，则愈合慢［1］。复方芙蓉花叶膏为外用于肛肠病术后促进伤口愈合的制剂［2］，抑菌作用明显［3］。复方芙蓉花叶膏是由芙蓉花叶、黄柏、地榆炭、大黄组方，按 1.7 ∶1 ∶1 ∶1 的配比炼制而成，炼制过程较复杂。作为中药复方制剂，因缺乏基础研究和理论支持，其推广应用受到了限制。本研究中探讨了复方芙蓉花叶不同提取物的体外抑菌作用，为进一步开发复方芙蓉花叶新药提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与菌种

仪器：DF-101D型集热式恒温加热磁力搅拌器，SZCL-2型数显智能控温磁力搅拌器，YRE-2000A型旋转蒸发器（巩义市予华仪器有限责任公司）；JA2003型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司，精度为1 mg）；YXQ-50SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器、GZX-9070MBE型电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；BDS60型电热三用水箱（北京市医疗设备厂）；UV-2800A型紫外可见分光光度计（尤尼柯＜上海＞仪器有限公司）；SPX-70BⅢ型生化培养箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；BSW-850H型水平层流净化工作台（苏州洁净技术研究所）；350 μL石英微量比色皿；35 mm玻璃培养皿；250 mL索氏提取器。

试药：地榆炭（湖南省衡东县中药饮片厂）；芙蓉花叶、黄柏、大黄均购自湖南馨恒堂中药科技有限公司，干燥，粉碎，备用；Mueller-Hinton琼脂培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司）；其余试剂均为国产分析纯。

菌种：大肠埃希菌Escherichia coli、表皮葡萄球菌Staphylococcus epidemidis均由南华大学病原生物学研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 供试液制备

乙醇提取物制备：取混合药材粉末（芙蓉花叶9.04g，黄柏 5.32 g，大黄 5.32 g，地榆炭 5.32 g）25 g，精密称定，用滤纸装好，置250 mL索氏提取器中。用8倍量70%乙醇在100℃左右油浴锅中冷却回流3 h，过滤，收集滤液，将滤渣用6倍量70%乙醇依法再提取2次，收集3次的混合滤液；用旋转蒸发仪浓缩，温度控制在65℃，浓缩至50 mL时将浓缩液置电热套中蒸发浓缩至糊状，再放入干燥箱中干燥至恒重。以上操作重复多次。

乙酸乙酯萃取物制备：取乙醇提取物适量，溶于约100 mL蒸馏水中，制成混悬液，加入石油醚去除色素、油脂等杂质，萃取多次，直至石油醚层透亮和颜色不再变化为止。移去石油醚层，留下水相加入1.5倍量的乙酸乙酯连续萃取多次，每次留下乙酸乙酯层，直至乙酸乙酯层不再变色为止。收集乙酸乙酯层，置旋转蒸发仪中进行浓缩，温度控制在55℃，蒸发至固体状。取出，置干燥箱中，干燥至恒重。以上操作重复多次。

水提取物制备：取混合药材粉末（芙蓉花叶9.04 g，黄柏 5.32 g，大黄 5.32 g，地榆炭 5.32 g）25 g，精密称定，置500 mL烧瓶中，加8倍量蒸馏水，在温度调至145℃左右的电热套中回流煎煮3 h，过滤，收集滤液，常温保存。回收滤渣，置于500 mL烧瓶中，加入6倍量蒸馏水，用酒精灯煎煮2 h，过滤，收集滤液，以上操作重复2遍。合并3次收集的滤液，置于烧杯中，置电热套中蒸发浓缩，电热套温度调至100℃左右，浓缩呈膏状，置干燥箱中，干燥至恒重。以上操作重复多次。

供试液制备：分别取适量乙醇提取物、乙酸乙酯萃取物和水提取物，用0.9%氯化钠溶液配制成质量浓度为0.5 g／mL的提取物溶液，灭菌，备用。

1.2.2 MH 培养基制备

将MH琼脂培养基与蒸馏水按42∶1 000的比例配制，121℃高压灭菌20min，置50℃恒温水浴箱中，备用。

1.2.3 菌液制备

取2只无菌培养皿，装入融化的无菌培养基，待培养基凝固后，在无菌条件下将大肠埃希菌与表皮葡萄球菌用划线法分别接种到不同培养皿的培养基上。放入37℃恒温培养箱中培养12 h，置4℃冰箱中冷藏；取出活化好的菌种，在无菌环境下，用无菌接种环吸取适量大肠埃希菌，置装有2 mL无菌0.9%氯化钠溶液的试管中，吸取适量，置比色皿中，采用分光光度计测细菌OD值法，配制大肠埃希菌和表皮葡萄球菌的浓度在107～108cfu／mL范围内。

1.2.4 抑菌试验

取11只直径为3.5 cm的无菌培养皿，分别标记为1～11号，用标记笔将培养皿划分为Ⅰ区（大肠埃希菌区域）和Ⅱ区（表皮葡萄球菌区域）。采用二倍稀释法，往2～11号培养皿中加入1.5 mL灭菌0.9%氯化钠溶液，往1号培养皿中加入1.5 mL药物质量浓度为0.5 g／mL的乙醇提取物，往2号培养皿中加入1.5 mL药物质量浓度为0.5 g／mL的乙醇提取物，充分混匀，再从2号培养皿中吸取1.5 mL混合液加入3号培养皿，充分混匀，再从3号培养皿中吸取1.5 mL混合液加入4号培养皿，依法直至加入至9号培养皿，再从9号培养皿中弃去1.5 mL混合液。最后往1～9号培养皿中均加入4 mL无菌水解酪蛋白琼脂（MHA）培养基，迅速混匀，冷却凝固，制成药物质量浓度分别为 136.36，68.18，34.09，17.05，8.52，4.26，2.13，1.07，0.53 g ／L 的营养琼脂平板。第10号培养皿仅加入4 mL无菌MHA培养基，作为阴性对照。用无菌接种环通过划线法分别接种大肠埃希菌及表皮葡萄球菌于1～10号培养皿相对应区域。第11号培养皿不加提取药物且不接种细菌，作为空白对照。再将11只培养皿一同放入37℃恒温培养箱中培养18～24 h。以上操作均严格遵守无菌操作原则。同法操作乙酸乙酯萃取物及水提取物，且每种提取物对2种细菌分别做3次重复试验。观察不同提取物及其不同药物质量浓度对大肠埃希菌及表皮葡萄球菌的抑制作用，并记录最低抑菌浓度（MIC）值，即在体外培养细菌18～24 h后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物质量浓度。

2 结果

2.1 药物提取率

结果见表1。

表1 3种提取方法的药物提取率比较

2.2 对大肠埃希菌及表皮葡萄球菌的体外抑菌效果

3种方法的提取物均能对大肠埃希菌和表皮葡萄球菌产生较明显的抑菌效果，详见表2。其中，阴性对照组有大肠埃希菌及表皮葡萄球菌生长，空白对照组无细菌生长，且3次重复抑菌试验结果一致。乙醇、乙酸乙酯及水提取方案对大肠埃希菌的MIC分别为68.18，4.26，68.18 g／L；对表皮葡萄球菌的MIC分别为34.09，1.07，4.26 g ／L。可见，乙酸乙酯萃取提取的复方芙蓉花叶提取物的抑菌作用最强，详见表3。

3 讨论

复方芙蓉花叶是一种外用于促进肛肠疾病术后伤口愈合的制剂，其为芙蓉花叶、黄柏、地榆炭和大黄配伍而成。芙蓉花叶味辛，性平，无毒，具有凉血、解毒、消肿、止痛等功效［4-5］，且芙蓉花和叶均具有抗菌作用［6］。黄柏味苦，性寒，具有清热解毒之功效，现代药理学研究发现其具有抗菌、镇咳、降血压、修复溃疡、改善免疫功能等作用，其抗菌有效成分是小檗碱［7-8］。地榆炭味苦，性凉，具有凉血止血之功效［9-10］。大黄味苦，性寒，具有泻下攻积、泻火解毒、活血祛瘀及清泄湿热等功效，现代药理学研究发现，大黄不仅具有泻下、利胆、保肝的作用，还有止血、抗感染的作用［11］。大黄抗菌有效成分是大黄酸、大黄素、芦荟大黄素，其抗菌作用机制是影响叶酸的酶系统，抑制细菌核酸和蛋白质合成，抑制细菌生物氧化酶系统，诱生干扰素［12-13］。因此，无论从中医理论，还是现代药理学角度来看，复方芙蓉花叶均能有效抗菌和促进伤口愈合。此外，复方芙蓉花叶膏在肛周疾病及肛周术后的临床应用中，也证实了其具有较强的抗菌和促进伤口愈合的作用。

本研究结果显示，经水提取的提取率最高，其抑菌作用较乙醇提取强；经乙酸乙酯萃取尽管提取率最低，但其抑菌作用最强。应用挥发性有机溶剂提取中药，能有效、快速地提取有效成分。应用乙醇有机溶剂提取，不仅能快速去除水溶性杂质，还能保证有效成分的完整性［14-15］。乙酸乙酯萃取是在乙醇提取基础上进一步萃取，进一步浓缩有效成分。3种提取方案均是为了浓缩有效成分，去除杂质。

复方芙蓉花叶提取物对大肠杆菌及表皮葡萄球菌的体外抑菌试验结果表明，3种提取方案对大肠埃希菌和表皮葡萄球菌均有明显的抑菌效果，但对表皮葡萄球菌的抑菌效果优于大肠埃希菌，这可能是复方芙蓉花叶中某一种物质对表皮葡萄球菌有特异性抑菌活性。3种提取物的MIC表明，乙酸乙酯萃取物对大肠埃希菌及表皮葡萄球菌的MIC最小，尽管乙酸乙酯萃取过程较其他2种方法复杂，提取率也最低，但抑菌效果最佳。

表2 3种提取方法的复方芙蓉花叶提取物体外抑菌效果比较

表3 3种提取方法的复方芙蓉花叶提取物对试验菌的 MIC（g／L）

综上所述，乙醇提取、乙酸乙酯萃取及水提取复方芙蓉花叶的提取物均能对大肠埃希菌和表皮葡萄球菌产生抑菌作用，其中抑菌效果最佳的提取方法是乙酸乙酯萃取。