Cr6+对红树蚬摄食率及其抗氧化酶活性的影响

2020-10-21 08:05张程凯郭云鹏

海南大学学报（自然科学版） 2020年3期

张程凯，黄勃，逯峰，郭云鹏，程遂

(海南大学海洋学院，海南海口 570228)

红树蚬(Polymesodaerosa(Solander)隶属于软体动物门、双壳纲、异齿亚纲、帘蛤目、蚬科、蚬属.红树蚬广泛分布于热带及亚热带红树林区，主要栖息于河口处的半咸水地区.红树蚬属于大型蚬类，其成体壳长可达10 cm，其对外界环境变化的耐受性极强，尤其对干露和高温的耐受性远超其他海洋双壳类[1].在我国，红树蚬主要分布于广西、广东、海南、福建和台湾等地区.近年来，随着海洋污染，尤其是重金属污染的日益加重，红树蚬的生存受到越来越大的威胁.铬(Cr)是自然环境中普遍存在的重金属之一，其价态具有可变性，三价铬(Cr3+) 自然分布于环境介质及生物体内，而六价铬(Cr6+)则主要来自于人为的污染[2-3].近年来，海南岛周边的铬离子污染日益严重，在北部东寨港、清澜港、新盈港等三个红树林湿地的表层沉积物中Cr元素都达到了轻度以上的富集[4].铬离子虽然是多种动物所必须的微量重金属元素之一[5]，但若生物体摄入过量的铬离子则会产生巨大的毒害作用.研究表明，Cr6+更容易透过细胞膜而渗入细胞中，在细胞内发生氧化还原反应，被还原为Cr3+，同时产生大量的活性氧自由基( reactive oxygen species，ROS) ，引发氧化胁迫，并影响蛋白质、DNA结构和功能的完整性．进而引起细胞的癌变与损伤[6].摄食率(Ingestion Rate，IR)是贝类的重要生理参数，也是在生物调控、养殖容量及生态影响等方面研究贝类所不可缺少的重要指标[7].双壳类贝类的摄食多为滤食性，其主要通过鳃组织来完成，鳃作为双壳类动物的呼吸器官而与水环境直接接触，水体里的毒物是通过鳃组织而到达其他组织器官的，因此，重金属污染对双壳类鳃组织的损伤尤为直接与严重，它对其摄食率具有重大影响.

目前，针对红树蚬的研究报道较少，早先对红树蚬的研究主要集中在生态学和繁殖生物学等几个方面[8-9].近年来，国内对红树蚬的研究主要集中在化学物质胁迫下的毒理学研究和分类学研究[10-13]，而对红树蚬在重金属胁迫下的氧化应激反应变化及其摄食率的相关研究却鲜有报道.由于海南岛红树林区的重金属铬污染日益严重，因此对重金属铬的相关毒理学研究应加紧展开.为此，本研究采用毒性胁迫实验方法，对Cr6+胁迫下红树蚬的摄食率及其超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性变化情况进行了初步研究，旨在研究在Cr6+毒性胁迫下红树蚬的摄食率及其两种抗氧化酶活性的变化情况，以期为铬离子污染的生态风险评价提供理论依据，同时也为预防贝类铬中毒和建立相关的分子毒理学指标提供基础的数据资料.

1 材料与方法

1.1 实验材料实验所使用的红树蚬采自八门湾海区的霞场村附近海域，共采集红树蚬300个，具体规格见表1.取回后，使用洁净海水对红树蚬进行清洗，在去除其壳表面污物与附着物后，将其置于两个养殖箱中暂养.将海水盐度调至20，并连续充气，水温保持在(27±1)℃.暂养期间每天定时使用虹吸法进行换水，换水率70%，换水结束后投喂足量的螺旋藻粉.

表1 实验用红树蚬的生物学数据

数据结果表示为平均值 ±标准差

1.2 实验方法

1.2.1 摄食率的测定及其计算方法使用重铬酸钾进行Cr6+胁迫实验，根据预实验的结果，设定Cr6+质量浓度梯度为0 mg/L、30 mg/L、60 mg/L、180 mg/L、360 mg/L，分别在0 h，4 h，8 h，12 h，24 h，48 h取样，测定红树蚬的摄食率.每个时间组设置2个对照组，其中不放入红树蚬；设5个平行组，每个平行组中放入5个红树蚬，实验水体为4 L，在小养殖箱中进行实验.实验期间投喂螺旋藻液，实验水体中螺旋藻液的质量浓度为10 mg/L，实验时间为2 h，实验过程中对水体进行微曝气，防止螺旋藻粉出现沉淀.实验结束后将红树蚬取出，从每个质量浓度梯度的2个对照组和5个试验组中各取500 mL水样，并使用玻璃纤维滤膜(Whatman 1820-047)进行抽滤，将抽滤后的滤膜折叠，用锡箔纸包好，放入60 ℃的烘箱中烘干48 h，取出后称重.根据所测定水体中螺旋藻的质量，计算出螺旋藻液的终末质量浓度，然后根据以下公式计算红树蚬在Cr6+胁迫下的摄食率.在抽滤结束后，将已经取出的红树蚬进行编号，测量湿重，并将其解剖，取出软体部，然后将其放入烘箱中烘干48 h，取出后测定软体干重.

摄食率(IR)的计算使用如下两个公式[14]：

IR=V[(Ce0/Cet)-(Cc0/Cct)]/wt，

式中：V为试验溶液体积(mL)；w为试验用贝的组织干重(g)；t为试验时间(h)；Ce0为试验开始时试验组的藻类质量浓度(mg/L)；Cet为t时间时试验组的藻类质量浓度；Cc0为试验开始时空白对照组的藻类质量浓度；Cct为t时间空白对照组的藻类质量浓度.

1.2.2 酶活测定方法使用重铬酸钾进行六价铬(Cr6+)的胁迫实验，各梯度Cr6+的质量浓度、取样时间与摄食率实验相同.每个时间点取5个红树蚬，然后迅速将所有红树蚬置于冰盘上解剖，取其鳃组织，先用纯水冲洗，然后用滤纸吸干，称其重量，取各组约500 mg样品置于冰浴离心管中，向其中加入1 mL预冷的纯水，用电动匀浆机在冰浴条件下匀浆 1 min，然后使用低温离心机将匀浆液在4 ℃条件下以3 500 r/min离心15 min，取上清液备用.

采用南京建成生物工程研究所有限公司生产的试剂盒来检测CAT、SOD、GSH的活动，相应操作参照说明书进行，并使用酶标仪进行测定.对于红树蚬鳃组织中总蛋白含量的测定则使用南京建成生物工程研究所有限公司生产的考马斯亮蓝试剂盒来进行测定.

1.3 数据分析采用 SPSS 23. 0 软件对实验数据进行差异分析(one-way analysis of variance)，用 Duncan 法进行多重比较，实验数据均采用平均值±标准偏差来表示，显著性水平设为0. 05.

2 结果

2.2 Cr6+对红树蚬摄食率的影响从图1可以看出，不同质量浓度的Cr6+对红树蚬摄食率的影响具有很大的差异.不同质量浓度下红树蚬的摄食率均以0 h数据为空白对照.Cr6+质量浓度为30 mg/L时，红树蚬的摄食率大小在48 h内未出现显著差异(P>0.05)，但总体呈现下降的趋势，48 h组相较0 h组，其摄食率大小下降约43.89%；Cr6+质量浓度为60 mg/L时，红树蚬的摄食率在48 h时发生显著下降(P<0.05)，对比0 h组发现，其下降幅度大于Cr6+质量浓度为30 mg/L时的下降幅度，较0 h组下降57.91%；Cr6+质量浓度为120 mg/L时，红树蚬的摄食率从4 h起就发生显著下降，并在实验开始后的第8 h和第48 h时均较前一时间组发生显著下降(P<0.05)，在此浓度下，0 h组的摄食率大小为48 h组的6.75倍；Cr6+质量浓度为180 mg/L时，红树蚬的摄食率同样从4 h起就发生显著下降(P<0.05)，与120 mg/L下的实验结果相似，4 h组至12 h组的实验数据呈下降趋势，但差异不显著(P>0.05)，但与120 mg/L质量浓度下不同的是，本质量浓度下红树蚬的摄食率在24 h时较前一时间组发生了显著下降(P<0.05)，且48 h时摄食率出现了略微的回升，摄食率的最小值出现在24 h组，较0 h组(空白对照)下降了81.45%；Cr6+质量浓度为360 mg/L时，摄食率在4 h组和8 h组均较前一时间组发生了显著下降(P<0.05)，在实验结束时，红树蚬的摄食率已经到达了极低的水平，仅为0 h组(空白对照)的5.13%.以上结果表明，虽然红树蚬的摄食率在不同质量浓度的Cr6+胁迫下都会下降，但随着实验时间的延长，红树蚬的摄食率下降速度与程度显著增大.对相同时间下不同Cr6+处理的红树蚬摄食率数据进行对比，除0 h数据外，每个取样时间点均呈现相似的摄食率变化趋势.实验开始0 h时，红树蚬的摄食率大小无差异，均处在一个较高的水平；实验开始4 h时，红树蚬在Cr6+质量浓度为120～360 mg/L下，其摄食率较30 mg/L下的摄食率显著下降(P<0.05)，实验开始4 h直至48 h实验结束时，红树蚬在Cr6+质量浓度为120～360 mg/L下，其摄食率较30 mg/L下的摄食率显著下降(P<0.05)，各时间点在Cr6+质量浓度为60 mg/L下的摄食率均较30 mg/L时的摄食率无明显差异(P>0.05)，其对比结果与4 h时的实验结果类似.

小写字母代表各组数据间的显著性比较，字母不同代表差异显著(P≤0.05).图1 Cr6+胁迫下红树蚬的摄食率

2.3 Cr6+对红树蚬抗氧化物活力的影响

2.3.1 Cr6+对红树蚬鳃组织中 SOD含量的影响从图2可以看出，不同质量浓度的Cr6+对红树蚬鳃组织中SOD活性的影响具有很大的差异.不同质量浓度下红树蚬摄食率均以0 h数据为空白对照.Cr6+浓度为30 mg/L时，从4 h组开始红树蚬鳃组织中SOD的活性显著增加(P<0.05)，直至实验结束，4 h至24 h组的SOD活性始终维持在很高的水平，未出现显著差异(P>0.05)，48 h组的SOD活性较前4组发生略微下降，SOD活性最高出现在12 h组，每毫克蛋白质为167.00 U；Cr6+质量浓度为60 mg/L时，组织中SOD活性的变化趋势与30 mg/L质量浓度下基本相同，但24 h组和48 h组的SOD活性均较前一时间组别发生显著下降(P<0.05)，SOD活性最高出现在12 h组，每毫克蛋白质为172.64 U；Cr6+质量浓度在120 mg/L时，组织中SOD活性的变化趋势仍然与30 mg/L质量浓度下组织中SOD活性的变化趋势基本相同，但24 h组和48 h组的SOD活性均较前一时间组别发生显著下降(P<0.05)，48 h组的鳃组织SOD活性已回落至0 h(空白对照)组的水平，SOD活性最高同样出现在12 h组，每毫克蛋白质为164.04 U；Cr6+质量浓度在180 mg/L时，组织中SOD活性的变化趋势与30 mg/L质量浓度下组织中SOD活性的变化趋势基本相同，48 h组的SOD活性已低于0 h(空白对照)组，SOD活性最高出现在12 h组，每毫克蛋白质为154.23 U；Cr6+质量浓度在360 mg/L时，SOD活性在12 h组就发生显著下降(P<0.05)，12 h组至48 h组的SOD活性均小于0 h(空白对照)组，SOD活性最高出现在4 h组，每毫克蛋白质为148.32 U.以上结果表明，在同一Cr6+质量浓度下，随着实验时间的延长，SOD活性呈先升高后下降的趋势.对相同时间下不同Cr6+处理的红树蚬鳃组织的SOD活性数据进行对比，SOD活性在0 h组和4 h组内，Cr6+各质量浓度处理下的SOD活性均未发生显著变化(P>0.05)；在8 h组中，Cr6+质量浓度在180和360 mg/L时，红树蚬较组内其他质量浓度下的SOD活性发生了显著下降(P<0.05)；在12 h组中，Cr6+质量浓度在360 mg/L时，红树蚬较组内其他质量浓度下的SOD活性发生了显著下降(P<0.05)；在24 h组中，红树蚬鳃组织的SOD活性从120 mg/L开始发生显著下降(P<0.05)，随着质量浓度的提高，SOD活性再次发生显著下降(P<0.05)；在48 h组中，红树蚬鳃组织中SOD活性从120 mg/L开始发生显著下降(P<0.05)，且随着质量浓度的提高，SOD活性仍未发生显著变化(P>0.05).以上结果表明，在同一个时间组中，SOD活性的下降程度随着Cr6+质量浓度的升高而增大，这证明红树蚬摄食率的下降存在着显著的剂量效应.

小写字母代表各组数据间的显著性比较，字母不同代表差异显著(P≤0.05)图2 Cr6+胁迫下红树蚬鳃组织的SOD活力

2.3.2 Cr6+对红树蚬鳃组织中CAT活力的影响从图3可以看出，不同质量浓度的Cr6+对红树蚬鳃组织CAT活性的影响具有很大的差异.不同质量浓度下红树蚬鳃组织的CAT活性均以0 h数据为空白对照.Cr6+质量浓度在30 mg/L时，从4 h组开始红树蚬鳃组织中CAT的活性显著增加(P<0.05)，直至实验结束，4 h至24 h组的CAT活性始终维持在很高的水平，未出现显著差异(P>0.05)，48 h组的CAT活性较前四组发生略微下降，CAT活性最高出现在8 h组，每毫克蛋白质为83.03 U；Cr6+质量浓度在60 mg/L时，组织中CAT活性的变化趋势与30 mg/L质量浓度下组织中CAT活性的变化趋势基本相同，但24 h组和48 h组的CAT活性均较前一时间组别发生显著下降(P<0.05)，CAT活性最高出现在8 h组，每毫克蛋白质为80.66 U；Cr6+质量浓度在120 mg/L时，组织中CAT活性的变化趋势仍然与30 mg/L质量浓度下组织中CAT活性的变化趋势基本相同，但24 h组和48 h组的CAT活性均较前一时间组别发生显著下降(P<0.05)，48 h组的鳃组织CAT活性已回落至0 h(空白对照)组的水平，CAT活性最高出现在8 h组，每毫克蛋白质为79.23 U；Cr6+质量浓度在180 mg/L时，组织中CAT活性的变化趋势与30 mg/L质量浓度下组织中CAT活性的变化趋势基本相同，48 h组的CAT活性已低于0 h(空白对照)组，CAT活性最高出现在8 h组，每毫克蛋白质为82.58 U；Cr6+质量浓度在360 mg/L时，CAT活性在12 h组就发生显著下降(P<0.05)，12 h组至48 h组的CAT活性均小于0 h(空白对照)组的CAT活性，CAT活性最高出现在8 h组，每毫克蛋白质为81.10 U(图3).以上结果表明，在同一Cr6+质量浓度下，随着实验时间的延长，CAT活性呈先升高后下降的趋势.

对相同时间下不同Cr6+处理的红树蚬鳃组织CAT活性数据进行对比，CAT活性在0 h组、4 h组和8 h组内各质量浓度Cr6+处理下的CAT活性均未发生显著变化(P>0.05)；在12 h组中，Cr6+质量浓度在360 mg/L时，红树蚬CAT活性较组内其他质量浓度下的CAT活性发生显著下降(P<0.05)；在24 h组中，红树蚬鳃组织CAT活性从180 mg/L开始发生显著下降(P<0.05)，Cr6+质量浓度在360 mg/L时，红树蚬CAT活性较180 mg/L质量浓度下的CAT活性发生显著下降(P<0.05)；在48 h组中，红树蚬鳃组织CAT活性从60 mg/L开始发生显著下降(P<0.05)，随着质量浓度的提高，CAT活性在180 mg/L质量浓度下再次发生显著变化(P>0.05).以上结果表明，在同一个时间组中，CAT活性的下降程度随着Cr6+质量浓度的升高而增大，这证明红树蚬摄食率的下降存在显著的剂量效应.

小写字母代表各组数据间的显著性比较，字母不同代表差异显著(P≤0.05)图3 Cr6+胁迫下红树蚬鳃组织的CAT活力

3 讨论

3.1 Cr6+胁迫对红树蚬和摄食率的影响铬是重金属污染中危害最大的污染之一，它对土壤沉积物、水域及水生动植物均存在不同程度的影响及潜在的危害[15-17].先前的研究表明，海南岛东寨港与八门湾红树林区的沉积物中铬含量明显高于其他重金属的含量[18]，已达到轻度污染级别.红树蚬属于红树林中常见的大型底栖生物，在海南省各地的红树林区均有分布，其食性为滤食性，通过其鳃吸入海水，并对所吸入的海水进行滤食处理以获取食物[19]，因此，鳃在红树蚬摄食过程中起最重要的作用.吴林德等[20]的研究表明，在多种重金属胁迫下，泥蚶鳃组织细胞会发生细胞核皱缩及细胞破裂.Sunila[21]对Cd胁迫下紫贻贝鳃结构的观察也发现其鳃组织出现血腔膨大、血细胞聚集以及鳃丝出现融合、断裂等现象.贝类的摄食率是反映贝类生理状况的重要指标，也是贝类能量学以及养殖容量学研究中的重要基础参数.本次研究使用毒性胁迫实验的方法，测定了Cr6+不同质量浓度胁迫下红树蚬的摄食率，随着实验的进行，红树蚬的摄食率发生明显的下降，且Cr6+的质量浓度越高，红树蚬的摄食率下降越快.在较低Cr6+质量浓度(30 mg/L)胁迫下，红树蚬的摄食率在12小时内未发生显著下降，在后续的实验时间中也未发生较大幅度的下降.究其原因，应是红树蚬对低质量浓度的重金属胁迫具有较高的抵抗作用，而高质量浓度的Cr6+在实验期间对红树蚬的鳃组织造成了较严重的损伤，超出了其机体的自我修复能力，故致使鳃组织发生病变坏死.

3.2 Cr6+胁迫对红树蚬鳃组织抗氧化酶活性的影响研究表明，水生生物在受到重金属胁迫时，会产生大量的ROS，在正常情况下，生物体会通过SOD、CAT等抗氧化酶的联合作用来完成对ROS的清除.重金属离子进入生物体内后，在其组织内氧化或水解的过程会产生大量的O2-，SOD可与O2-发生歧化反应，使其转化为H2O2[22].但H2O2在细胞内过量堆积亦会对细胞产生损伤，因此，生物体会诱导产生大量的CAT，将H2O2催化生成H2O和O2[23]，对H2O2进行清除，从而减轻重金属离子对生物体的损害，使生物体克服并适应不良环境.赖廷和等[24]的研究发现，红树蚬胃组织中SOD、CAT与MDA的活力在Cd胁迫下具有显著的增强，曾丽璇等[25]对Cd、Cu胁迫下河蚬CAT活力的研究也获得了相似的结果.Ciacc等[26]的研究表明，非致死浓度(0.1 μmol/L)的Cr6+会使贻贝血液中的O2-含量显著上升.本研究使用了不同质量浓度的Cr6+对红树蚬进行胁迫，结果显示，不同质量浓度的Cr6+对红树蚬鳃组织的抗氧化酶活性均具有很大影响，实验初期，Cr6+胁迫会使红树蚬鳃组织中的SOD和CAT活性显著升高，并迅速达到峰值，随着实验的进行，在较低质量浓度的Cr6+胁迫下，SOD与CAT的活性始终维持在一个较高的水平，但在高质量浓度的Cr6+胁迫组中，SOD与CAT的活性随着实验的进行而发生显著地下降，此结果表明，红树蚬在Cr6+胁迫下，其前期反应较敏感，会产生大量的 SOD 和CAT，用以分解超氧化物阴离子自由基以及H2O2，SOD 和 CAT 在防御过程的早期发挥了重要作用，且SOD的响应速度快于CAT的响应速度.而随着胁迫时间的延长，到了实验后期，当活性氧积累超过了一定的限度时，就可能对细胞生物膜和酶系统产生破坏.Cr6+可通过细胞内负责运送磷酸根等阴离子的酶系统直接被细胞吸收[27]，从而对磷酸根离子的跨膜运输造成影响，致使细胞的能量代谢产生障碍，进而影响红树蚬鳃组织对氧化应激的抵抗作用.

3.3 关于将红树蚬作为环境监测标记物的探讨红树蚬作为一种滤食性贝类，其体内可以积聚大量的重金属元素，因此，它具有作为环境监测生物标记物的可能.研究表明，多种双壳类生物已经被广泛用于海洋环境污染的生物监测[28-29].刘伟成等的研究发现，大弹涂鱼在较低浓度的Cd胁迫下其肝脏的SOD活性对水体中污染物具有很好的指示作用，但CAT活性则不适用于指示水体污染.曾丽璇等人的研究表明，河蚬软体组织中的CAT活性可以作为检测Cd、Cu污染的有效生物标记物，但同样对重金属浓度有一定的要求，超出浓度区间其指示作用显著降低.结合先前的研究结果认为，生物标志物的有效性与组织器官种类、污染物种类和浓度有着密切的关系.