有机酸对泡菜亚硝酸盐和生物胺的抑制作用

肖付才，刘凯，陈凤仪，李二虎*

(1.许昌职业技术学院 园林与食品工程学院，河南 许昌 461000；2.华中农业大学 食品科学技术学院，武汉 430070)

泡菜是我国传统发酵食品之一，以其丰富的营养和独特的风味深受食客喜爱[1]。不当的加工方式不仅导致泡菜营养品质降低，而且会造成亚硝酸盐和生物胺含量超标等食用安全问题[2-4]。目前国内研究者为了降低泡菜中亚硝酸盐和生物胺等有害物质已做了大量的研究，如筛选降解亚硝酸盐的菌株[5-7]，优化发酵工艺[8]，添加生姜、大蒜、辣椒等辅料，添加维生素C、多酚提取物、植酸等材料[9,10]。外源添加有机酸可以降低泡菜发酵液的pH值，有效抑制硝酸盐还原菌的生长，促进亚硝酸盐的降解[11-13]。但有关外源有机酸对泡菜发酵过程中生物胺生成量的影响，以及有机酸能否同时抑制泡菜中亚硝酸盐和生物胺累积的相关报道不多。在保证泡菜食用品质的前提下，进一步降低泡菜中亚硝酸盐和生物胺的含量，研究通过添加柠檬酸、苹果酸及乳酸，从理化、微生物、安全及感官等方面探究了有机酸对泡菜品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大白菜、食盐：许昌胖东来超市；乳酸菌发酵粉(包含植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌)：北京川秀科技有限公司；生物胺标准品：美国Sigma公司；柠檬酸、苹果酸、乳酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇：德国Merck公司；4-氟-3-硝基三氟甲苯(FNBT)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

e2695高效液相色谱仪 美国Waters公司；Milli-Q A10超纯水处理器 美国Millipore公司；Genius 3微型旋涡混合仪 德国IKA公司；3-18K高速冷冻离心机 德国Sigma公司；DCY-12B可调式氮吹仪 上海泉岛科贸有限公司；pHS-3E酸度计 上海雷磁仪器厂；UV-1700紫外可见光分光光度计 日本岛津公司；GWWF-50恒温震荡水浴锅 常州市国旺仪器制造有限公司；SPX-250B III恒温培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 材料处理

泡菜制作的基本配方[14]：大白菜1.5 kg、凉开水2 kg、食盐60 g、发酵粉1.5 g。

制作方法：白菜预处理→装坛→加食盐水(发酵粉/有机酸)→加水密封→发酵(32 ℃，5 d)→每天取样冷藏。

试验组：未添加有机酸(CK)、1%柠檬酸(CA)、1%苹果酸(MA)、1%乳酸(LA)，添加比例为有机酸与白菜的质量比。

样品预处理：用洁净干燥的筷子将泡菜小心从坛中取出，用清水洗去表面残留的泡菜汁液，用滤纸擦干，称重记录，加适量蒸馏水，用搅拌机搅拌成糊状后再用手持式匀浆机匀浆5 min以上，6000 r/min、4 ℃离心4 min，取上层清液即得到泡菜匀浆。

1.4 理化指标测定方法

1.4.1 pH值的测定

参考GB 5009.237-2016《食品pH值的测定》。

1.4.2 总酸的测定

参考GB 5009.239-2016《食品酸度的测定》。

1.4.3 氨基酸态氮的测定

参考GB 5009.235-2016《食品中氨基酸态氮的测定》。

1.4.4 亚硝酸盐的测定

参考GB 5009.33-2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》。

1.4.5 生物胺的测定

参考GB 5009.208-2016《食品中生物胺的测定》。

1.5 微生物指标测定方法

1.5.1 菌落总数的测定

参考GB 4789.2-2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》。

1.5.2 乳酸菌数的测定

参考GB 4789.35-2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》。

1.6 感官评价

对发酵5 d后所得泡菜进行感官评价，评价指标：颜色、酸味、鲜味、脆度、整体可接受性。邀请10名感官鉴别人员对泡菜5项指标分别打分(5分制)，其中1=很差，3=中等，5=很好。

1.7 数据统计及图表绘制方法

使用Microsoft Excel 2010进行数据整理，使用Origin 2019b进行作图分析，SPSS 24.0软件进行统计分析。利用ANOVA、LSD进行差异显著性检验和多重比较，“P<0.01”的统计数值被认为是差异极显著，“P<0.05”的统计数值被认为是差异显著。所有数据都是3次测试的平均值，数据统一采用平均值±标准偏差(Mean±SD)形式表示。

2 结果与分析

2.1 泡菜发酵过程中pH值与总酸含量变化

对添加不同有机酸的泡菜每隔1 d测定pH值和总酸含量，结果见图1和图2。

图1 泡菜发酵过程中pH值的变化Fig.1 Changes in pH values of pickle during fermentation

由图1可知，4组泡菜的pH值在发酵过程中不断下降。对照组pH值从初始的6.35下降到3.95，添加1%柠檬酸、1%苹果酸以及1%乳酸组的pH值分别从5.95，5.88，5.91降至3.65，3.66，3.59；发酵中后期pH值缓慢下降直至趋于稳定，发酵第5天，4组泡菜的pH值大小为1%柠檬酸组<1%乳酸组<1%苹果酸组<对照组，且各组之间差异不显著。

图2 泡菜发酵过程中总酸含量的变化Fig.2 Changes in total acid content of pickle during fermentation

由图2可知，随着发酵的进行，4组泡菜总酸含量均呈上升趋势。与对照组相比，发酵前添加1%柠檬酸、1%苹果酸和1%乳酸显著增加了发酵各阶段泡菜中的总酸含量(P<0.05)。发酵过程中，对照组总酸的增加速率为0.08%/d，显著高于有机酸处理组。

2.2 泡菜氨基酸态氮在发酵过程中的变化

添加有机酸对泡菜中氨基酸态氮含量变化的影响结果见图3。

图3 泡菜发酵过程中氨基酸态氮含量的变化Fig.3 Changes in amino acid nitrogen content of pickle during fermentation

4组泡菜中氨基酸态氮含量的变化趋势基本一致，均在发酵1 d后增加至最大值，随后不断下降直至趋于稳定。对照组泡菜中氨基酸态氮含量的最大值为0.34 g/kg，显著高于其他3组(P<0.05)。随着发酵的不断进行，4组泡菜中氨基酸态氮含量的差异逐渐缩小，发酵第5天时对照组氨基酸态氮含量降至0.16 g/kg，添加1%柠檬酸、1%苹果酸以及1%乳酸组泡菜的氨基酸态氮含量分别为0.14，0.13，0.12 g/kg，与对照组无显著差异(P>0.05)。

2.3 泡菜菌落总数和乳酸菌数在发酵过程中的变化

添加有机酸对泡菜发酵液菌落总数的影响见图4。

图4 泡菜发酵过程中菌落总数的变化Fig.4 Changes in total number of colonies of pickle during fermentation

对照组菌落总数在发酵1 d内快速增加，由初始的6.5 lg CFU/mL增至8.7 lg CFU/mL，随后缓慢下降至稳定，发酵5 d后降至7.7 lg CFU/mL。添加1%柠檬酸、1%苹果酸以及1%乳酸组的菌落总数也呈现出先增后降的变化趋势，但菌落总数的峰值和第5天的值均显著低于对照组(P<0.05)。

添加有机酸对泡菜发酵液乳酸菌数的影响见图5。

图5 泡菜发酵过程中乳酸菌数的变化Fig.5 Changes in lactic acid bacteria number of pickle during fermentation

4组泡菜发酵液乳酸菌数的变化趋势与菌落总数基本一致，均在发酵第1天达到峰值，随后呈不断下降(对照组)或基本保持不变(添加有机酸组)。添加有机酸组的乳酸菌数在整个发酵过程中均显著低于对照组(P<0.05)。发酵第5天，对照组的乳酸菌数比菌落总数低，说明发酵液中还含有一定量的其他菌，而添加有机酸的泡菜发酵液中乳酸菌数与总菌落数相差很小，说明发酵液中其他菌的量很少或者基本没有。

2.4 泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量的变化

添加有机酸对泡菜中亚硝酸盐含量变化的影响结果见图6。

图6 泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量的变化Fig.6 Changes in nitrite content of pickle during fermentation

对照组泡菜的亚硝酸盐含量在发酵第1天迅速上升并达到峰值44.34 mg/kg，随后不断下降。添加1%柠檬酸、1%苹果酸以及1%乳酸组泡菜中亚硝酸盐含量的变化比对照组平缓得多，均在发酵第2天达到最大值，分别为1.99，4.39，2.28 mg/kg，均显著低于对照组(P<0.05)。发酵5 d后，添加1%苹果酸和1%乳酸组的亚硝酸盐残留量无显著差异(P>0.05)，添加1%柠檬酸组亚硝酸盐含量最低，相比于对照组降低了97.21%。

2.5 泡菜发酵过程中生物胺含量的变化

1%柠檬酸、1%苹果酸及1%乳酸对泡菜发酵过程中6种生物胺和总生物胺含量的影响见表1。

表1 添加有机酸对泡菜生物胺含量的影响Table 1 The effect of organic acid addition on biogenic amine content of pickle

续 表

随着发酵的进行，泡菜中生物胺总量逐渐增加。发酵第5 天时，对照组泡菜中生物胺总量达到138.41 mg/kg，显著高于其他3组(P<0.05)。添加1%柠檬酸、1%苹果酸及1%乳酸组泡菜中生物胺总量与对照组相比分别降低了40.46%、36.13%和37.29%。

由表1可知，4组泡菜中组胺含量随发酵的进行不断增加，发酵第5天，对照组泡菜中组胺含量显著高于其他3组(P<0.05)。添加1%柠檬酸、1%苹果酸以及1%乳酸组泡菜中组胺含量相比于对照组分别降低了46.73%、33.27%和39.85%。泡菜中色胺含量在发酵前3 d显著增多(P<0.05)，随后变化不显著(P>0.05)，发酵结束时，4组泡菜中色胺含量在20.00 mg/kg左右，且无显著差异(P>0.05)。除添加1%乳酸组泡菜以外，其他3组泡菜中β-苯乙胺含量在整个发酵过程中显著增加(P<0.05)，发酵结束时，添加1%柠檬酸、1%苹果酸及1%乳酸组泡菜中β-苯乙胺含量显著低于对照组(P<0.05)，且这3组的β-苯乙胺含量差异不显著(P>0.05)。泡菜原材料中检测出腐胺和亚精胺两种生物胺，对照组泡菜中腐胺含量在整个发酵阶段显著上升(P<0.05)，添加有机酸组腐胺含量则没有显著的变化(P>0.05)，发酵第5天，1%柠檬酸对腐胺的抑制作用最强，使其含量相比于对照组降低了42.59%。亚精胺的变化趋势与腐胺相似，即添加3种有机酸均减小了亚精胺含量的增长幅度，因而发酵结束时，添加1%柠檬酸、1%苹果酸及1%乳酸组的亚精胺含量均显著低于对照组(P<0.05)。泡菜的整个发酵过程中，仅在对照组的检测到尸胺，且其含量随发酵时间的延长而显著增多(P<0.05)。

2.6 有机酸对泡菜感官品质的影响

表2 有机酸对泡菜感官品质的影响Table 2 The effect of organic acids on sensory quality of pickle

由表2可知，添加有机酸后泡菜产品的整体感官品质优于对照组，其中添加1%柠檬酸组泡菜的整体可接收性得分最高，为4.89分。在颜色、酸味及脆度方面，添加1%柠檬酸、1%苹果酸及1%乳酸组泡菜得分均显著高于对照组(P<0.05)，且3组之间得分无显著差异(P>0.05)，其中添加1%柠檬酸组泡菜的酸味得分达到感官评价的最高分5分。在鲜味方面，添加1%柠檬酸和1%乳酸组得分高于其他两组，但差别不显著(P>0.05)。

3 结论

添加1%柠檬酸、1%苹果酸及1%乳酸降低了发酵泡菜的pH值，增加了总酸含量，缩短了发酵时间，抑制了泡菜发酵过程中的菌落总数和乳酸菌数，显著降低了泡菜中亚硝酸盐及生物胺的含量。综合泡菜产品的感官品质，整体可接受性得分顺序为1%柠檬酸组>1%乳酸组>1%苹果酸组>对照组。