苦荞灌肠抗氧化性能及体外淀粉消化特性

李晓玲

（山西大学生命科学学院，山西太原 030006）

荞面灌肠是一种传统风味小吃，主要由荞麦粉和小麦粉混合加工而成。荞麦为蓼科荞麦属双子叶植物，是一种重要的杂粮作物，具有生育期短、适应性强、耐贫瘠等优点[1]。我国的荞麦种植面积和产量位居世界第一，主要有甜荞（Fagopyrum esculentum） 和苦荞（Fagopyrum tataricum） 2个栽培品种[2]。荞麦药食同源，富含各类氨基酸、维生素及矿物元素[3-4]，是唯一一种含有维P的粮食作物[5]，其丰富的黄酮类化合物对氧化应激引起的慢性衰退性疾病，如冠心病、高血压、糖尿病及肿瘤等具有显著的预防和辅助治疗功效[6]。另外，荞麦制品消化性低，食用后容易使人产生饱腹感，可作为糖尿病患者或减肥者的食物[7]。由于荞麦独特的药理作用，市场上已经开发出多种荞麦功能食品，如荞麦柿叶茶、荞麦豆酱、荞麦面包等[8-9]。甜荞和苦荞加工产品各有特色，据报道在黏性、拉伸力及感官评定3个食用品质评价指标中甜荞面条优于苦荞面条，在烹调品质方面则无显著差异[10]。然而，苦荞中抗氧化活性物质含量远高于甜荞，如苦荞黄酮含量是甜荞的4倍[11]；荞麦中最主要的黄酮类物质芦丁在苦荞中的含量是甜荞的49倍[12-13]；一种重要的抗癌物质槲皮素在苦荞干粉中的含量为0.01%～0.05%，但在甜荞中未检测到[14]。目前市场上的荞面灌肠使用的荞麦主要为甜荞，为了强化食品的营养价值，将苦荞粉与小麦粉按不同比例混合制作成特色小吃灌肠，通过对其总酚含量、黄酮类物质含量、抗氧化性能、消化特性及感官评定等综合分析，确定二者适宜的添加比例，为荞麦灌肠及其他荞麦类功能性食品的开发提供一定理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

苦荞粉，山西黑丰1号苦荞，经中药粉碎机粉碎后，过80目筛。

葡萄糖测试试剂盒，上海荣盛生物药业有限公司提供；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） （ABTS）、胃蛋白酶、α-淀粉酶、Folin-Ciocalteu试剂，北京市索莱宝科技有限公司提供；亚油酸，萨恩化学技术（上海） 有限公司提供；芦丁、没食子酸、NaOH，生工生物工程（上海） 股份有限公司提供；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ-250B型超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；HC-2518型高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；THZ-D型台式恒温振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；水浴锅，北京市长风仪器仪表公司产品；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品；TU-1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；高效液相色谱仪，大连伊力特分析仪器有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 灌肠的制作

苦荞灌肠配方见表1。

表1 苦荞灌肠配方

按照表1称取不同组分，混合调至面糊呈线状滴落后，倒入浅盘蒸20 min，趁热脱模冷却，即可得到4组苦荞添加量分别为10%，30%，50%，70%的灌肠。

1.3.2 样品提取液的制备

取不同苦荞灌肠样品的同一位置，如中心处的样品5 g，用50 mL体积分数80%的甲醇研磨成匀浆，于40℃下超声波提取15 min。重复提取2次，将2次超声波提取后的悬浮液一并移至离心管，以转速6 000 r/min离心10 min。将上清液转移至圆底烧瓶中，45℃下旋转蒸发至干。最后用甲醇溶解并定容至10 mL，得到样品提取液。

1.3.3 总酚的测定

以没食子酸作为标准品，采用Folin-ciocalteu法测定样品中的总酚含量[5]。配置浓度为0.11 mol/L的没食子酸溶液，分别吸取没食子酸溶液0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mL于试管中，加入2 mL蒸馏水及0.6 mL福林酚试剂，用7%的碳酸钠定容至10 mL，避光放置90 min后，于波长760 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，没食子酸质量浓度（μg/mL）为横坐标，得到标准曲线，其回归方程为：Y=0.005 4X-0.003 6，R2=0.999 0。吸取0.125 mL样品提取液，按照上述方法测定样品于波长760 nm处的吸光度根据标准曲回归方程计算样品中总酚浓度。

1.3.4 总黄酮的测定

以芦丁作为标准品，采用醋酸-醋酸钠-三氯化铝显色法[15]，测定波长270 nm处吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁质量浓度为横坐标，得到标准曲线，其回归方程为Y=1.388 4X+0.006 1，R2=0.994 0。取样品液0.1 mL，采用同样方法测定吸光度，并根据回归方程计算总黄酮质量浓度。

1.3.5 清除DPPH自由基能力测定

取苦荞灌肠提取液0.1 mL，加入0.65 mL甲醇、1.25 mL DPPH溶液（200 mg/mL），混匀后避光放置30 min，于波长517 nm处测定吸光度。用甲醇代替提取液作为对照管。按以下公式计算样品对DPPH·的清除率（SE），清除率越大表明清除DPPH·的能力越强[16]。

式中：A1——对照组吸光度；

A2——样品组吸光度。

1.3.6 β-胡萝卜素-亚油酸抗氧化体系

取 3 mg β - 胡萝卜素、45 μL亚油酸及 350 μL吐温-20，用氯仿定容至10 mL。取2 mL至梨型烧瓶中，45℃旋转蒸干后用蒸馏水定容至100 mL，剧烈摇晃，使其达到氧饱和，形成乳化液。在试管中加入3.6 mL乳化液，加入0.1 mL样品，测定波长470 nm处吸光度。结果用抗氧化能力系数（AAC）来表示[17]。

式中：As(60)——样品在60 min时的吸光度；

Ac(60)——空白管在60 min时的吸光度；

Ac(0)——空白管在0 min时的吸光度。

1.3.7 总淀粉含量的测定

取2 g苦荞灌肠样品，加20 mL蒸馏水研磨成匀浆。用α-淀粉酶将淀粉液化完全后，再用糖化酶糖化完全，将糖化液以转速8 000 r/min离心10 min，取上清液得到淀粉完全水解后的糖液[18]。以葡萄糖为标品，采用葡萄糖氧化酶法测定糖液中的葡萄糖含量，根据标准品质量浓度，于波长505 nm处测吸光度得到标准曲线，其回归方程：Y=2.687 1X-0.005 9，R2=0.998 6。糖液中葡萄糖的含量乘以折算系数0.9得到总淀粉含量。

1.3.8 体外模拟淀粉消化

称取5 g灌肠样品，用50 mL蒸馏水研磨成匀浆。取1 mL匀浆液于锥形瓶中，加入20 mL HCl溶液（pH值1.5） 和0.4 mL胃蛋白酶液（5 IU），于37℃下恒温振荡1 h后用浓度为0.5 mol/L的乙酸钠缓冲液定容至25 mL，再加入5 mL α-淀粉酶（2.6 IU），40℃振荡3 h，分别在不同消化时间（0，30，60，90，120，180 min） 取样1 mL，100℃沸水浴5 min使酶失活，测定各个水解时间的淀粉水解程度[19]。

1.3.9 胰酶抑制活性测定

称取5 g样品，用20 mL蒸馏水研磨成匀浆，转移至离心管中，以转速10 000 r/min离心10 min，取上清液备用。在试管中加入1 mL测活缓冲液（pH值8.0，0.1 mol/L Tris-HCl，1 mmol/L CaCl2）、100 μL胰蛋白酶溶液，50 μL样液，于37℃温浴3 min后，加入15 μL BApNA （0.15 mol/L，溶剂为二甲基亚砜） 启动反应，15 min后加入0.5 mL体积分数为33%的醋酸终止反应。以缓冲液代替胰蛋白酶溶液作为空白管，以蒸馏水代替样品液为对照管，测定波长410 nm处吸光度[20]。按照下式计算抑制剂对胰蛋白酶的抑制率。

式中：A1——样品管吸光度；

A2——对照管吸光度。

1.3.10 感官评定

由15人组成评分小组，从外观形状、组织结构、风味、色泽及口感5个方面进行评定[21]。

苦荞灌肠的感官评价见表2。

2 结果与分析

2.1 苦荞灌肠中总酚和总黄酮的含量

不同添加量苦荞灌肠的总酚含量见图1。

由图1可知，随着苦荞添加量的增加，灌肠中多酚类物质的含量呈递增趋势。当灌肠中苦荞粉的添加量达到70%时，酚类物质质量浓度最高，为314.0±10.57 μg/mL样品提取液，明显大于10%，30%，50%的苦荞灌肠，后者分别为51.8±1.60，201.6±3.24，239.1±3.04 μg/mL样品提取液。

表2 苦荞灌肠的感官评价

图1 不同添加量苦荞灌肠的总酚质量浓度

不同添加量苦荞灌肠的总黄酮质量浓度见图2。

图2 不同添加量苦荞灌肠的总黄酮质量浓度

由图2可知，随着苦荞添加量的增加，灌肠中黄酮类物质的质量浓度逐渐增加。当灌肠中苦荞粉的添加量达到70%时，黄酮类物质质量浓度最高（173.63± 4.23 μg/mL样品提取液），明显大于10%，30%，50%的苦荞灌肠（分别为46.04±3.53，97.52±2.17，112.52±2.55 μg/mL样品提取液）。

2.2 苦荞灌肠的抗氧化能力

不同添加量苦荞灌肠的DPPH自由基清除率见图3。

图3 不同添加量苦荞灌肠的DPPH自由基清除率

DPPH是一种稳定的以氮为中心的自由基，常用于测定许多化合物或植物提取物的抗氧化活性[22]。由图3可知，苦荞灌肠提取物具有清除DPPH·的能力，且随苦荞添加量增加，清除率呈增大趋势，苦荞添加量增加至50%后，增加的趋势变缓。当苦荞添加量增加至70%，灌肠提取物对DPPH·的清除率为86.84%±4.30%。

不同添加量苦荞灌肠的β-胡萝卜素漂白能力见图4。

图4 不同添加量苦荞灌肠的β-胡萝卜素漂白能力

由图4可知，苦荞灌肠提取液具有抗氧化能力，随着苦荞添加量增加，抗氧化能力增强。苦荞添加量为10%～50%时，提取液抗氧化能力显著增高，高于50%后，抗氧化能力趋于稳定。70%苦荞灌肠提取液的抗氧化系数达到3 560±76。

苦荞灌肠抗氧化能力随苦荞含量升高而增强，这一现象与之前随着苦荞添加量增加灌肠中总酚和黄酮含量升高的结果一致。

2.3 体外模拟淀粉消化

不同添加量苦荞灌肠的淀粉水解率见图5。

由图5可知，随消化时间的延长，各样品的淀粉水解率逐渐增大。4组样品水解速率均在前30 min内最快，30 min后速率降低。在30 min时，10%和30%苦荞添加量组的淀粉水解率已经达到95%以上，50%和70%苦荞添加量组的水解率相对较慢，分别为84.08%±3.04%和68.85%±2.50%。10%和30%苦荞添加量组的消化曲线基本重合，150 min时淀粉基本水解完全。50%和70%苦荞添加量组在120 min时的淀粉水解率分别为93.61%±2.72%和85.17%±2.44%。

图5 不同添加量苦荞灌肠的淀粉水解率

2.4 苦荞灌肠中胰蛋白酶抑制剂活性

不同添加量苦荞灌肠胰蛋白酶抑制剂活性见图6。

图6 不同添加量苦荞灌肠胰蛋白酶抑制剂活性

由图6可知，灌肠中胰蛋白酶抑制剂的活性随着苦荞粉添加量的增加而增强，表明苦荞粉中存在胰蛋白酶抑制剂。30%添加量苦荞灌肠略高于10%苦荞灌肠中的胰蛋白酶抑制活性，而50%的苦荞灌肠中胰蛋白酶抑制活性明显高于10%和30%苦荞添加量的灌肠。70%苦荞添加量组对胰蛋白酶活性的抑制率为43.74%±2.77%。灌肠中苦荞灌肠提取液中胰蛋白酶抑制活性反映了胰酶抑制剂的变化。在试验中，蒸汽加热20 min后并不能使抑制剂活性完全丧失，表明苦荞中的胰蛋白酶抑制剂具有一定的耐热性。

2.5 灌肠的感官评价

苦荞灌肠的感官评价结果见表3。

表3 苦荞灌肠的感官评价结果/分

10%苦荞添加量的灌肠外观形状和组织结构项得分最高，30%和50%苦荞添加量灌肠口感得分最高。随着灌肠中苦荞粉添加量的增加，灌肠的颜色逐渐加深至深褐色。70%苦荞灌肠虽然风味十足，但颜色太深，外观及口感均最差，总分最低。50%苦荞灌肠虽然在外观形状及组织结构项得分低于10%苦荞灌肠，但其风味、色泽及口感均最佳，总分最高。因此，从感官评价结果看，在制作苦荞灌肠时苦荞粉和小麦粉的质量比1∶1为最适比例。

3 结论

通过将苦荞粉与小麦粉按1∶9，3∶7，5∶5，7∶3的比例混合制成灌肠，测定苦荞灌肠的酚类物质含量、黄酮类物质含量、抗氧化性能及其胰蛋白酶抑制剂活性。结果显示随着苦荞粉添加量的增加，样品中多酚类、黄酮类物质的含量升高，70%苦荞添加量组提取液中多酚和黄酮的质量浓度分别为 239.1±3.04 μg/mL 和 112.52±2.55 μg/mL。随着苦荞添加量的增加，灌肠提取液抗氧化性能也越来越强，70%苦荞灌肠提取液的抗氧化系数为3 560±76，对DPPH·的清除率达到86.84%±4.30%。苦荞灌肠的抗氧化能力与苦荞中重要的功能成分酚类物质和黄酮类物质有关，特别是芦丁含量。据报道，虽然苦荞在加水后的加热加工过程中芦丁含量会有所降低，但其水解产物槲皮素含量相应增加，而槲皮素同样具有较好的抗氧化性[23]。苦荞灌肠是酚类、黄酮类等功能性成分摄入的良好来源。

体外模拟淀粉消化试验结果显示，随着苦荞添加量增加，淀粉消化速率降低。70%苦荞添加量组淀粉经150 min消化后未能水解完全，消化率为85.17%±2.44%。其原因可能与苦荞淀粉结晶度高、溶解性差、抗性淀粉含量高（7.5%～35%） 有关[24]。据报道，由于苦荞淀粉的独特性，长期食用可以预防血糖、血脂升高，具有减肥、治疗便秘的功效[25]。

随着苦荞添加量增加，灌肠提取液胰蛋白酶抑制活性增大，70%苦荞添加量组对胰蛋白酶活性的抑制率为43.74%±2.77%。传统认为，蛋白酶抑制剂是食物中的一种抗营养因子，因此对蛋白酶抑制剂的研究一直集中于其灭活方法上。然而，如今营养过剩较营养不良更普遍，蛋白酶抑制剂是抗营养因子的看法也在转变。另外，最近研究表明，某些蛋白酶抑制剂可延长线虫的健康寿命[26-27]，蛋白酶抑制剂的生物活性有待进一步开发。

从感官评价（外观形状、组织结构、风味、色泽及口感）结果看，50%苦荞添加量组灌肠得分最高；70%苦荞添加量组虽然总酚、总黄酮含量最高，但因色泽、口感差，感官评分最低。因此，在制作苦荞灌肠时，苦荞粉和小麦粉的质量比1∶1为最适比例。苦荞灌肠的感官品质除了与苦荞的主要成分即苦荞淀粉的理化性质有关，应该还与其含有丰富的多酚物质有关。多酚类物质可与淀粉分子发生复杂的相互作用，从而改变淀粉的流变学特性、热力学特性、凝胶特性和消化性等。苦荞富含多酚物质，极具生理功能潜力，进一步研究苦荞多酚与淀粉的相互作用，对提高淀粉类食品的加工及营养品质具有积极的指导意义。