食源性微生物检测及溯源研究进展

粟丽千,张 伦,王 建,卢雪梅,*

(1.广东药科大学生命科学与生物制药学院,广东广州 510006;2.广东省生物活性药物研究重点实验室,广东广州 510006;3.广东药科大学药学院,广东广州 510006)

食源性疾病是指经摄食进入人体的各类致病因子引起的一类疾病,通常包括食物中毒、肠道传染病、人兽共患病等,这类疾病常伴随中毒症状且具有一定的传染性,是当前人们广泛关注的卫生问题[1]。世界卫生组织对2010年全球食源性疾病负担的评估报告中指出:食源性致病微生物是引起人类患食源性疾病的最主要原因,食源性疾病造成的全球负担与艾滋病毒、疟疾及结核病等传染病相当[2]。

食源性致病微生物被认为是伴随食品生产及供应的整个过程中出现的,造成食品污染、腐坏及变质的生物因素,这类微生物以食物为媒介在人群及环境中广泛传播,可导致人体恶心、呕吐、胃痛、腹泻等,严重时可损伤脏器甚至诱发中毒性休克[3-4]。例如,志贺氏菌(又称痢疾杆菌)经侵袭作用进入人体肠道后,可通过内毒素及外毒素的双重作用破坏肠粘膜而引发人体肠道疾病,临床症状常表现为机体发热、腹痛腹泻、心衰等[5]。食源性致病微生物大体上可分为三类:一是致病菌,如鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌等;二是致病性病毒,如轮状病毒、冠状病毒、诺如病毒等;三是寄生虫,如猪带绦虫、旋毛虫、蛔虫等[6]。

传统的微生物检测及溯源方法通常是根据微生物基因型及表型进行检测或分型,包括培养基分离、形态观察、生化鉴定、抗生素耐性分析及血清学分型等[7-8]。由于食品中存在多种致病微生物,因此检测前通常需要对微生物进行选择性富集并分离,该过程不仅操作繁琐、耗时长,且难以实现复杂样品中多种微生物同时检测[9]。因此,探索更为高效简便的新型食源性微生物检测及溯源方法对预防食源性微生物中毒、快速锁定致病源并控制疾病传播具有重要的意义。本文对近几年出现的食源性致病微生物的检测及溯源方法进行综述,并对这些新技术的优缺点进行简要介绍,为食品安全监管提供一定的技术支撑和参考。

1 食源性微生物检测方法

1.1 免疫学检测法

免疫学检测法是利用抗原抗体间特异性结合的基本原理进行微生物检测,不同的微生物有其特异的抗原,并能激发机体产生相应的特异性抗体。基于此,可制备特异性单克隆抗体检测微生物的特异抗原,也可利用相应的微生物抗原检测体内产生的特异性抗体。免疫学检测法主要包括酶联免疫吸附技术(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫层析技术(immunochromatography assay,ICA)、免疫磁性分离技术(immunomagnetic separation,IMS)及免疫荧光(immunofluorescence)技术[10-11]。

免疫磁性分离技术又称免疫磁珠分离技术,该项技术与其他检测技术相结合可在致病菌的检测过程中发挥更大的作用[12]。例如,吕观等[13]利用免疫磁珠结合环介导等温扩增的方法检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌,优化实验条件后,所建立的方法在富集5 h后对牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌的检测限可达1.2 CFU/mL;富集7 h后,金黄色葡萄球菌的检测限可达4.4 CFU/mL。在众多的免疫检测方法中,标记的免疫层析技术应用较为普遍,包括胶体金标记的免疫层析技术、石墨烯标记的免疫层析技术、磁性纳米标记的免疫层析技术及量子点标记的免疫层析技术[14-15]。

表1列出了常见的免疫学检测法在食源性微生物检测中的应用举例。基于免疫学的检测方法最突出优点是检测特异性高,Zhang等[24]基于鸡抗蛋白A IgY和任意非特异性哺乳动物IgG的双重识别作用来检测金黄色葡萄球菌,通过优化体系,在未经富集的100 μL PBS溶液中,金黄色葡萄球菌的检测下限可达11 CFU/mL,线性范围为5.0×102～5.0×104CFU/mL,整个检测过程在90 min内即可完成。这种检测方法不仅特异性强,而且操作简便,为食品样品中金黄色葡萄球菌的检测开辟了一条新的途径。

表1 常见免疫学检测法应用举例

1.2 分子检测法

分子检测法主要是对微生物遗传信息扩增并检测比对,包括PCR及其各类衍生技术、DNA探针技术、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、核酸序列扩增技术(nuclear acid sequence-based amplification,NASBA)、DNA微阵列(又称基因芯片)技术等[25-28]。

在各类PCR检测方法中,多重PCR(multiple PCR)在检测的灵敏度及特异性方面有着独到的优势,具有高效性、系统性和经济简便性,可以同时检测或鉴定多种病原微生物,已广泛用于各类食品中微生物检测[29-30]。但由于PCR对检测样品中的靶微生物浓度要求较高,因此检测前通常需要将其富集以制备出高质量的DNA,这部分工作通常费时费力[31]。常用的方法有选择性培养增殖、离心、过滤或免疫吸附富集等方法。此外,数字PCR(digital PCR)是一种核酸分子绝对定量技术,将DNA或cDNA样品分割为许多单独、平行的PCR反应来稀释背景,从而实现更高的检测灵敏度、分辨率、速度和精密度[32]。

无法分辨存活和死亡的微生物是传统PCR法的一个主要缺点,这会导致误导性结果的产生。为了弥补这一缺陷,在提取DNA前,研究人员使用生物染料如单叠氮乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)或单叠氮丙啶(propidium monoazide,PMA)对样品进行预处理,使EMA/PMA嵌入死亡细胞的DNA中并与之共价结合,随后再按照常规方法进行DNA提取和扩增分析,死细胞DNA扩增反应被强烈抑制,这样可有效区分活细胞及死细胞的DNA[33]。目前,科学家已将该项技术用于检测各种微生物,包括食品和环境中的细菌细胞和孢子、真菌、病毒和酵母等[34]。Kragh等[35]利用PMA长扩增的方法建立了对食品中加工和热处理的单核细胞增生性李斯特菌活菌的定量PCR方法。Miotto等[36]评估了不同浓度PMA在不同光照时间和光照强度对细胞悬液和食物基质中大肠杆菌细胞的影响,确定了PMA浓度为50 μmol/L、光强650 W下处理15 min为大肠杆菌PMA-qPCR定量检测的最优条件。尽管EMA/PMA-PCR能有效区分活菌和死菌,但EMA/PMA-PCR的操作程序较为繁琐。Soejima等[37]创新性地使用铂化合物对水和牛奶中的活微生物和死亡微生物进行区分,铂化合物与EMA/PMA作用机理类似,但使用铂化物的PCR法更为简便快速。Canh等[38]使用脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,SD)预处理以提高EMA、PMA和顺式二氯二胺-铂金(cis-dichlorodiammineplatinum,CDDP)在RT-PCR方法中对病毒的定量效率,结果表明,SD预处理能有效增强3种活性标志物对病毒的穿透能力,且以SD预处理的CDDP-RT-qPCR方法最能反映病毒的感染性。

1.3 生物传感器技术

生物传感器是将生物分子反应转化为可定量观测的其他信号并进行放大的技术,主要由感受器和能量转换器两部分构成。生物传感器的原理为待测物质经感受器时与感受器上的敏感原件结合,这些敏感材料通常是具有生物活性的酶、抗原、抗体、细胞、微生物等,后经适当的能量转换将待测物质的浓度信息转化为光、电、声等信号并进行放大传输,最终在显示器上输出[39]。近年来,由固定化生物敏感材料作为识别元件的传感器用于微生物检测的技术相继报道,尤其是电化学生物传感技术,已广泛地应用于各类病原体的检测[40]。Zhang等[41]将大肠杆菌16S rDAN上的某一特定可变序列作为生物标记物,以寡核苷酸探针和纳米缝隙网络电极为传感元件,构建了一种可快速灵敏检测大肠杆菌的方法,检测下限可达100 CFU/mL。

在过去的十几年中,纳米材料的出现为下一代生物传感器的发展开辟了新的方向。Yin等[42]设计一种由胍基官能化上转换荧光纳米粒、鞣酸和过氧化氢组成的荧光纳米传感器,并将其成功应用于食品中七种常见细菌的同时检测。Nasrin等[43]基于金纳米粒子(AuNPs)和荧光CdSe TeS量子点的局域表面等离子体共振行为,提出了一种对诺如病毒具有良好选择性和灵敏度的无标记传感方法,该检测方法能在低病毒浓度下进行超灵敏检测,为开发高性能、高灵敏度的生物医学病毒检测传感探针提供了技术支持。此外,通过结合纳米材料的固有特性,在纳米尺度上设计电极界面控制以增强其传感能力,是近年生物传感器研究的热门话题,显露出良好的开发潜力[44]。新兴性能优良的纳米材料应用于生物传感器,不仅提高了生物传感器的传感能力,还使传感器具备了微型化的能力,为开发水源性和食源性病原体的检测提供了强大的技术支持[45]。

1.4 仪器检测法

用于微生物检测的仪器法主要包括光谱技术、质谱技术及色谱技术等。光谱技术具有非侵入和无损的特点,不仅可以降低检测成本,还可避免环境污染[46]。有“指纹图谱”之称的表面增强拉曼光谱(surface-enhanced raman scattering,SERS)在食源性微生物的检测中具有分析速度快、灵敏度高等优点[47]。Wu等[48]描述了一种基于适体的SERS技术用于检测海产品中副溶血性弧菌的方法,该方法将拉曼报告分子4-巯基苯甲酸与适配子修饰的金纳米颗粒(AuNPs)链接作为信号探针,并用镀金聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜增强拉曼散射,该方法有效地简化了分析过程,其检测线性范围为1.2×102～1.2×106CFU/mL,检出限为12 CFU/mL。此外,近红外光谱成像技术在食品的化学危害检测、微生物危害检测、物理危害检测等安全评估中发挥着不可或缺的作用[49]。Tao等[50]利用可见光-近红外光谱(visible-near-infrared,VIS-NIR)在400～2500 nm的光谱范围内检测了去壳花生仁中黄曲霉毒素B的污染情况,利用不同范围的全光谱数据建立偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型,对花生仁黄曲霉的污染进行了有效的鉴定。

质谱技术则更多地应用于腐败菌检测领域,同时也可以检测到革兰氏阳性菌,让食物中细菌有效分离并在质谱上得到验证[51]。熟肉类产品的包装通常存在细菌腐败的风险,Geeraerts等[52]利用质谱技术结合基因组DNA-PCR及基因测序的方法对熟火腿贮存过程中的挥发性物质进行分析,得出麦芽糖杆菌、萨氏乳杆菌和变形沙雷氏菌是熟火腿中存在的主要细菌类型,且挥发物质中的2,3-丁二醇、乙酸乙酯和乙醇等物质可作为腐败的标志。

色谱技术不仅可用于检测微生物本身,还更适用于微生物次级代谢产物的检测[53-54]。食品中的真菌毒素,尤其是黄曲霉毒素,是最具代表性的微生物代谢产物,具有一定的毒性[55]。Frimpong等[56]利用高效液相色谱分析了从辣椒中分离到的22株产毒真菌菌株,其中有11株菌株属于能产生黄曲霉毒素B1等有害物质的曲霉菌属、镰刀菌属和青霉菌属。

近几年来,几种技术联合应用的检测方法不断涌现,已逐渐成为当今主流检测手段之一。如Najat等[57]采用顶空-固相微萃取气相色谱-质谱(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)技术检测牛奶中沙门氏菌释放的挥发性有机化合物,这种检测方法可在37 ℃孵育5 h内检测和鉴定沙门氏菌。尽管仪器检测法具有样品消耗量低、分析检测快、应用范围广等优点,但也存在样品处理时间长、检测难以标准化等不足[58]。

1.5 其他检测方法

除上述几种常见的检测方法外,ATP生物发光技术及噬菌体检测技术也是当前研究的热点[59]。ATP生物发光技术通过检测食品中微生物ATP总量以反映食品受污染的严重程度,不仅具有省时、便捷、可现场检测等优点,还可用于大样本检测。寇晓晶等[60]采用免疫磁珠技术联合ATP生物发光技术用于食品中沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌及金黄色葡萄球菌的检测,该法不仅显著缩短了预增菌时间,还具有快速、低廉、易推广的特点。张志杰[61]利用纳米探针技术结合ATP生物发光技术设计了一种用于大肠杆菌检测的新型生物传感器,检测可在20 min内完成。ATP作为细胞内一种重要的代谢中间产物,一般情况下其含量较为稳定,因此,通过测定样品中的ATP含量即可间接获得样品中活菌总数。但若样品中含有非细胞性ATP,则检测结果易受影响[27]。

噬菌体是一种能够感染并杀死微生物的病毒,通过噬菌体受体结合蛋白(receptor binding proteins,RBPs)与宿主细胞表面的特异性受体结合,噬菌体这种可特异性结合宿主的特点赋予了噬菌体很高的生物技术潜力[62]。近年来,结合分子生物学、免疫学、纳米材料学及其他学科建立起来的新型噬菌体检测技术在食品微生物检测领域中显示出了巨大的优势。Xu等[63]设计了一种以野生型T4噬菌体为识别元件的新型电化学生物传感器用于活病原菌的检测,该方法显示出了区分活菌细胞和死亡细菌细胞的能力,在优化固定化条件后,其检测下限可达14±5 CFU/mL。噬菌体不仅具有体积小、结构简单、易侵袭、价格便宜等特点,还具有区分活细菌及死细菌的能力,使得噬菌体及其代谢产物在病原微生物的检测应用中受到越来越多的关注[64]。

2 食源性微生物溯源技术

2.1 基因分型技术

近年来,用于微生物溯源检测的基因型分型方法主要包括基于基因测序、基于酶切技术及基于PCR扩增的分型方法。其中,基于基因测序的分型方法主要包括基于核心基因组多位点序列(core genome multi-locus sequence typing,cgMLST)分型技术及基于全基因组的单核苷酸多态性(whole genome single nucleotide polymorphisms,wgSNP)分型技术;基于PCR扩增的分型方法主要包括基于多位点可变数目串联重复序列(multiple locus variable-number tandem repeat analysis,MLVA)分型技术、基于规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)分型技术以及基于重复序列扩增(repetitive sequence-based PCR,rep-PCR)分型技术;基于酶切技术的分型方法主要是脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)技术[65]。表2对这几种分型方法的优缺点进行了归纳,在实际应用中,研究者应当综合实验目的及实验条件合理选择分型方法。

表2 几种基因分型技术的优缺点

2.1.1 基因测序技术 基因测序技术是收集病原体的遗传物质并扩增、测序,将测序结果与现有数据库比对分析进行溯源的方法。从1977年第一代DNA测序技术,即双脱氧链终止法发展至今,基因测序技术经历了一次又一次变革。按测序原理的不同,该项技术的发展可划分为四个阶段:第一代,双脱氧链终止法,是现在应用最多的核酸测序技术,但这种方法通常耗时较长,通量低,成本高;第二代,高通量测序技术,又称下一代基因测序技术(next generation sequencing,NGS),主要以边合成边测序技术为代表;第三代,单分子测序技术,测序过程无需进行PCR扩增;第四代,纳米孔长读长测序技术[69]。

传统的多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)方法是根据MLST数据库提供的引物来设计PCR以扩增待检测菌的高保守性管家序列,根据管家的基因型确定相应的ST类型,通过比对这些管家基因序列的差异对菌株进行分型[68]。闫瑞等[70]将7个位点的多位点序列(7-loci multilocus sequence typing,7-loci MLST)分型法对2438株克诺罗菌株进行分析,定义了ST4、ST1、ST7和ST13四种主要序列型,由于MLST仅对选取的7个管家基因进行分型,导致了同一ST型中包含了不相关菌株,因而溯源效果不佳。Ghanem等[71]将25个不同的滑膜支原体全基因组序列分成302个核心基因组,并将这302个核心基因组其作为cgMLST分型的靶基因(占MS基因组的35.5%),分型结果显示,基于cgMLST的系统进化树分型结果与基于核心基因组单核苷酸多态性分析及现有的流行病学信息高度一致,且cgMLST的高分辨力允许在相同MLST类型的样品之间进行进一步区分。

与cgMLST类似,wgSNP则是比对细菌基因组中的单核苷多态性的差异而进行分型的技术。Pisarenko等[72]使用wgSNP方法将1961～2016年间从俄罗斯西伯利亚地区收集的10株炭疽杆菌基因组与GenBank数据库中已有的185株炭疽菌基因组进行对比分析,确定了俄罗斯分离株在炭疽菌全球进化系统中的重要地位。

WGS分型结果准确率高,常用于临床疾病诊断、流行病学研究、毒力基因及耐药基因筛选[73]。2019年12月,中国湖北省武汉市爆发了由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)所致的肺炎感染,武汉华南海鲜市场曾被认为是疫情传播的“万恶之源”。Yu等[74]利用WGS对此次SARS-CoV-2病毒的进化和传播途径进行分析,研究学者们基于病毒样本中的120个变异位点得到了58种单倍型,发现来自华南海鲜市场患者的病毒基因主要与H1单倍型有关,而作为更古老的H3、H13以及H38单倍型样本则来源于华南海鲜市场之外,提示武汉华南海鲜市场可能不是此次新型冠状病毒的发源地。与传统分型方法相比,WGS成本低、测序快,且不同地区的实验室可以通过PulseNet公共数据库进行数据分享[75-76]。当前,由86个国家组成的PulseNet国际网络已发展成为一个全球实验室网络,WGS也已成为该网络中用于代替分子亚型检测法的主要候选者[77],但通常用于WGS的仪器较为昂贵。

2.1.2 基于PCR扩增的分型技术 MLVA分型是扩增微生物上多个可变数目串联重复序列(variable number tandem repeat,VNTR),扩增产物经毛细管电泳后根据不同VNTR位点数目差异进行分型[78]。Hosseini-Nave等[79]用PCR法检测了37株肠道聚集性大肠杆菌(entero-aggregativeEscherichiacoli,EAEC)的11个毒力基因,并以MLVA分析这些菌株的遗传亲缘关系,发现EAEC属于具有多种毒力因子的异质性大肠杆菌群。王磊等[80]发现,在一起致泻性大肠埃希菌所致的感染疫情中,MLVA的分型结果和脉冲场凝胶电泳(PFGE)的分型结果一致,但MLVA具有更快速、更简便、通量更高的特点。

典型的CRISPR-Cas系统通常包括前导序列、CRISPR阵列以及CRISPR相关蛋白编码基因(CRISPR associated genes,cas)蛋白组成,CRISPR阵列中的间隔序列的插入或丢失等可准确反应致病菌菌株或血清型间的关系,因而可用于细菌分型和流行病学研究[68]。Xie等[81]用CRISPR分型法对中国2009～2017年间来自人和动物的173株鼠伤寒沙门氏菌及其单相变异沙门氏菌进行基因分型,发现TST4是ST34分离株中最常见的CRISPR型,并揭示猪是我国鼠伤寒沙门氏单相变异菌的主要宿主。

rep-PCR属于自动化的基因分型系统,该方法通过PCR扩增细菌的非编码重复序列,将扩增片段进行电泳分离后通过分析软件进行分型[82]。Prasertsee等[83]使用rep-PCR分型法分析了从肉类食品和人类病例中分离出来的沙门氏菌血清型间的遗传相关性,发现从肉类样品中分离到的沙门氏菌与人病例中的部分沙门氏菌具有完全相同的克隆。研究表明,rep-PCR对单核细胞增多性李斯特菌亚型的鉴别能力与PFGE分型方法类似,rep-PCR可作为单核细胞增多性李斯特氏菌亚型的一种替代方法[84]。类似地,李雪等发现,利用rep-PCR方法对溶藻弧菌分型与PFGE分型结果一致,且rep-PCR具有更廉价的特点[82]。

2.1.3 脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术 脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分型技术被认为是沙门氏菌分型检测的“金标准”。用于微生物溯源的PFGE技术是通过采集患者粪便或其所接触物品中的微生物,利用限制性内切酶将病原微生物DNA切割成许多小片段,按我国流行病致病菌识别网的规范,经脉冲凝胶电泳分离而对致病微生物分型[85]。整套的检测流程通常包括致病菌的生化鉴定、血清型分析、PFGE电泳、核酸分析及药敏性分析等[86-87]。因PFGE具有结果稳定、重复性好、成本低且易普及等优点,是当前国内用于食源性微生物(尤其是沙门氏菌)同源性追踪的最常用技术[88-89]。在2018年重庆市爆发的农村宴席食物中毒事件中,重庆市疾病预防控制中心利用PFGE技术成功判断了该事件是由餐饮人员在食品加工过程中引入肠炎沙门氏菌所致[90]。与其他基于PCR的分型技术相比,尽管在常规琼脂糖凝胶上分离条带的PFGE分型技术操作繁琐且重现性低,但由于PFGE对病原体检测结果易于标准化,加上可利用现有的数据库进行对比追踪,使得PFGE仍是各地疾病预防控制中心用于病原微生物分型的最常用技术[91]。

2.2 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption and ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)是依据细菌蛋白指纹图谱的特异性进行分型的方法,当激光照射到样品蛋白与基质形成的晶体时,基质从激光中获取能量并将这部分能量传给蛋白质使得蛋白质电离,电离形成的分子碎片经离子飞行时间(time of flight,TOF)检测器检测后可得到检测结果[92]。MALDI-TOF-MS最大的优点是可在较短时间内准确检出菌属水平信息,其准确率通常可维持在92.5%～99.0%[93]。Eiseul等[94]使用MALDI-TOF-MS对几种食物中葡萄球菌菌株的种类进行鉴定,经扩展直接转移提取法和甲酸提取法制备菌种并培养24 h后,葡萄球菌菌属水平信息的鉴定均达100%准确率。此外,微生物代谢产物分析及纳米磁珠等技术的使用有效拓宽了MALDI-TOF-MS的应用范围,为MALDI-TOF MS在食品监测和流行病学研究领域的推广及应用提供支持[95]。

2.3 变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术

变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)是利用标记基因获取微生物蛋白指纹图谱,通过对比图谱差异来对被污染物及污染源进行分析的电泳技术。1993年,Muyzer等[96]首次将DGGE应用于微生物群落研究;同年,许伟等[97]基于16S rDNA开发了PCR-DGGE技术。PCR-DGGE技术发展至今已广泛用于被污染水体中细菌种群的遗传多样性分析,该项技术最大特点是能够在微生物群落组成不断变化的过程中实施动态分析[98-99]。Kanchana等[100]在PCR-DGGE的基础上提出了逆转录酶—PCR-DGGE的技术,并将这种技术与常规PCR-DGGE一同用于混合弧菌的鉴定。结果显示,引入逆转录酶的方法使得分析结果具有更高的灵敏度。作为病原菌溯源分型的又一利器,PCR-DGGE不仅检测性高、分辨率好,而且无需对微生物进行培养。因此,这种方法不仅适用于分析水环境及土壤中微生物群落的组成及变化,还可以用于环境中的未知微生物群落的探索,是一项非常具有应用前景的技术[101]。

2.4 微生物源示踪技术

水是生命之源,也是食源性微生物大范围传播的重要媒介,人类的生活无一例外离不开水,受污染的水体用于人们的生活及农作物灌溉无疑是影响人类健康的重大风险因素。传统的微生物示踪(microbial source tracking,MST)技术主要是基于粪便指示菌(fecal indicator bacteria,FIB)的检测,但这种方法仅能表示水体被污染的程度,却不能指示污染的来源[102]。因此,孙志浩等[103]寻找了如粪便厌氧菌、噬菌体及指示病毒作为替代指示微生物以拓宽MST的应用。此外,基于第二代测序衍生的两种技术,一种是引入操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)概念的技术,另一种是SourceTracker程序,使得MST可以在更宽的范围内追溯粪便污染来源。引入OTU聚类分析的高通量测序技术不仅减少了测序的工作量,而且还能自动识别并去除一些测序错误的序列,有效提高了分析准确性[104]。Clairessa等[105]应用由Scott教授及其团队开发的Source Tracker软件基于贝叶斯算法对目标样本及微生物源样本的群落构成分析,根据分析结果可预测目标样本中的微生物在各微生物源样本中所占的比例。然而,尽管MST技术的应用已较为普遍,但其检测结果易受地理条件及环境气候的影响,且不同地区人体及动物肠道菌群存在较大的差异性,加上目前尚未出现能表征不同水体中病原菌污染的替代指示微生物,使得MST难以建立出一套标准化的检测方案[103]。

3 结论及展望

本文综述了近年来用于食源性微生物检测及溯源的新兴技术,并简要评述了这些技术的优缺点。在微生物的检测方法中,免疫学检测方法的突出特点就是高特异性,且不需要大型仪器,但基于免疫学的方法通常需要获得数量足够多的纯化细菌,免疫磁性分离技术恰可代替传统检测方法中富集细菌这一步骤,可有效缩短检测时间;分子检测方法通常具有快速、高效的特点,其中应用较为广泛的是PCR法,将PMA、EMA及铂类化合物应用到PCR方法中可克服传统PCR方法无法区分存活细菌和死亡细菌缺点,但基于分子检测的方法通常试剂盒较贵;生物传感器具有分析效率高、检测成本低、操作简单等优点,在食源性微生物的实时监测中发挥着重要作用[59];基于仪器的分析方法具有样品消耗量低、分析速度快、应用范围广等优点,但也存在样品处理时间长、检测难以标准化等不足;ATP生物发光技术具有省时、便捷、可现场检测等优点,但其检测结果易受非细胞性ATP的干扰;噬菌体检测技术具有易侵袭、特异性强、价格便宜的特点,但噬菌体的宿主谱较窄,往往只对细菌某种血清型或分离株有特异性[106]。在微生物溯源方法中,基因分型技术应用较广,且cgMLST、wgSNP及MLVA分型方法的结果均可数字化,便于建库;cgMLST分型方法分辨率高、复现性强,计算量较wgSNP少,而wgSNP则更适用于揭示病原菌进化史;基于CRISPR的分型技术通量高;rep-PCR分型操作简便且复现性高;PFGE分辨能力高、分型能力强且分型成本低,但操作过程较为繁琐;MALDI-TOF-MS具有分析速度快、通量高等特点,但此类方法需建立出相应的特征菌图谱库[92];微生物示踪技术则主要用于水体中粪便污染菌的溯源,但该种方法受环境、地区影响大,难以实现标准化检测。

综上所述,基于免疫学及分子生物学的微生物检测方法应用较广,这些方法检测特异性高,且通常不需要较高的操作技术即可完成;生物传感器及仪器分析法检测方法具有快速、简便的特点,但它们需要有大型仪器设备支撑,若实验条件满足,此类检测方法在微生物的实时监测中可发挥着重要作用。在各类溯源方法中,各类基因分型方法在完善了微生物信息数据库后,方可显示出强大的溯源能力;而PFGE则较适用于应对地方性小范围的微生物溯源分析。

总之,食源性致病微生物的检测及溯源在食品安全监管中至关重要,随着新材料新技术发展,食源性微生物的检测和溯源方法正朝着超灵敏、高通量、更快速的方向发展,同时,多种技术联合应用的方法在食源性致病菌的检测及溯源中发挥了重要的作用。食源性致病菌爆发的感染呈现区域化、全球化的趋势,因此,建立并完善微生物相关信息数据库,为各国应用微生物感染时快速准确地查找微生物来源、进而采取及时有效的措施具有重大的意义。同时,为保障人民免受食源性致病菌侵扰、减少国家经济损失,国家政府应加大对食品安全检测技术研发及微生物信息收集网络建设的资金和人员投入,让食品卫生安全监管的成果惠及百姓。