高效液相色谱法测定格隆溴铵注射液中有关物质

李彬芳 张 健

(苏州大学 药学院，江苏 苏州 215123)

格隆溴铵注射液的主要成分为格隆溴铵，主要用于手术前麻醉抗毒蕈碱作用。可减少唾液、气管支气管、咽喉分泌；减少胃液分泌的体积和游离酸度；在麻醉诱导和插管期间可阻断心脏迷走神经抑制反射。查询各国药典，该品种质量标准仅收载USP药典中，而现行及以往各版标准中没有有关物质控制方法。鉴于对注射剂质量标准的控制，本文建立了专属性强、灵敏度高、重复性好、操作简便的高效液相色谱(HPLC)检测法，用于测定格隆溴铵注射液中有关物质的含量。

1 仪器和试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪(Agilent 1260，安捷伦科技有限公司)，empower数据处理系统；SHH-220GSD-2T药品稳定性试验箱(重庆永生仪器厂)；

1.2 样品与试剂

1.2.1 样品

格隆溴铵注射液(批号：20171002，自制)；格隆溴铵对照品(批号：R005V0，USP)；杂质1(批号：160415，新恒创)；杂质2(批号：160421，新恒创)；杂质3(批号：2645-063A，TLC)；杂质4(批号：FOL437，USP)；杂质5(苯甲醛)(批号：170827，国药化试)。

1.2.2 试剂

庚烷磺酸钠(批号：H/0168/46，赛默飞Fisher)；无水硫酸钠(批号：20180626，国药化试)；浓硫酸(批号：20170912，国药花试)；甲醇(批号：186352，赛默飞Fisher)；乙腈(批号：193731，赛默飞Fisher)；双氧水(批号：20180418，国药化试)；氢氧化钠(批号：20160515，国药化试)；盐酸(批号：20180626，国药化试)；氯化钠(批号：20180828，国药化试)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACE Excel Super-5 250 mm×4.6 mm；流动相：流动相A庚烷磺酸钠缓冲液(0.25 g庚烷磺酸钠溶于615 mL的1.63 g·L-1的无水硫酸钠溶液中，加入3 mL 0.5 mol·L-1硫酸溶液，再加入甲醇150 mL，乙腈235 mL，混匀)-流动相B(乙腈)(梯度)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：215 nm；柱温：30 ℃；进样量：75 μL；运行时间：65 min。

梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab. 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的配制

空白溶液(稀释剂)：流动相A。样品溶液：取格隆溴铵注射液作为样品溶液。对照溶液：精密量取样品溶液适量，加稀释剂配制成每1 mL中约含格隆溴铵0.2 μg的对照溶液。系统适用性溶液：分别取格隆溴铵对照品、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4和杂质5各适量，精密称定，加稀释剂溶解制备成对照品贮备液。精密量取对照品贮备液适量，用稀释剂溶解并稀释制成1 mL中含格隆溴铵约0.2 mg，含杂质1～5各约0.2 μg的系统适用性溶液。

2.3 专属性试验

2.3.1 系统适用性试验

分别取系统适用性溶液、稀释剂、样品溶液和对照溶液各75 μL注入色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图(图1)。格隆溴铵与杂质5之间分离度大于4.5，各色谱峰之间最小分离度为4.6，对照溶液峰面积RSD为1.5，主成分和各杂质的峰纯度角均小于纯度阈值。稀释剂对各杂质无干扰，加入杂质的供试品混合溶液中各色谱峰能达到良好分离，说明本方法系统适用良好。

图1 系统适用性色谱图Fig. 1 Chromatogram of system Suitability solution

2.3.2 破坏试验

考察样品溶液在酸、碱、氧化、高温、光照条件下的降解情况，以及各破坏条件下杂质与主成分的分离情况，各破坏样品溶液的配制具体如下：

未破坏溶液：取格隆溴铵注射液作为未破坏溶液；

酸降解样品溶液：取格隆溴铵注射液2支，混合，加入1 mol·L-1盐酸0.1 mL，室温下放置9天后，加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液0.1 mL中和，即得。同法配制酸降解空白溶液。

碱降解样品溶液：取格隆溴铵注射液2支，混合，加入1 mol/L氢氧化钠0.1 mL，立即加入1 mol·L-1盐酸溶液0.1 mL中和，即得。同法配制碱降解空白溶液。

氧化降解样品溶液：取格隆溴铵注射液2支，混合，加入3%双氧水0.2 mL，置60 ℃水浴加热1 h，即得。同法配制氧化降解空白溶液。

高温降解样品溶液：取格隆溴铵注射液，置60 ℃恒温箱中放置10天，取出放冷至室温后即得。同法配制高温降解空白溶液。

光降解样品溶液：取格隆溴铵注射液，放置在光照强度为(5 000±500)lux的光照箱内10天，取出，即得。同法配制光降解空白溶液。

取上述溶液及稀释剂分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果，格隆溴铵注射液在酸、碱及高温降解条件下总杂质分别为2.96%、2.58%、1.12%，相对于初始总杂质(0.85%)有明显增加，说明本品在酸、碱和高温条件下不稳定，在光照和氧化条件下，总杂质分别为0.79%、0.92%，与初始值相当，说明本品在光照和氧化条件下稳定。在各破坏条件下，主要降解杂质均是杂质1；格隆溴铵与相邻杂质、已知杂质与相邻杂质能达到良好的分离度，格隆溴铵和主要降解杂质的纯度角均小于纯度阈值；各降解条件下物料平衡率均在90%～110%之间。本方法有较强的专属性。

2.4 溶液稳定性

按“2.2”项方法配制的对照溶液、样品溶液、系统适用性溶液，于室温下放置考察溶液稳定性，分别于0、2、4、8、12、24 h时间点进样分析，对照溶液24 h内，峰面积回收率(测定时间点的峰面积与0 h峰面积比值)在95%～105%；供试品溶液24 h内，最大未知杂质、总杂质与0 h的差值均不过0.02%，且没有新杂质产生；系统适用性溶液24 h内，各成分峰面积回收率(测定时间点的峰面积与0 h峰面积比值)均在95%～105%。说明对照溶液、供试品溶液及系统适用性溶液在室温条件下24 h稳定。

2.5 线性关系考察

分别精密量取2.2项下杂质1，2，3，4，5及格隆溴铵对照品贮备液，用稀释剂稀释制成一系列含各杂质及格隆溴铵对照品的溶液，按色谱条件下依次进样测定，记录峰面积，以峰面积对浓度进行线性回归。结果见表2。校正因子计算公式为：校正因子=格隆溴铵斜率/各杂质斜率。

表2 对照品线性关系及校正因子测定结果Tab. 2 The result of reference substance Linearity and Correction factor

2.6 检测限和定量限

2.6.1 定量限

取格隆溴铵、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4和杂质5的线性贮备液(见“2.5”项)，用稀释剂逐步稀释，当信噪比约为10～20时，即得到定量限溶液，上述各组分的定量限依次为0.042、0.008、0.003、0.02、0.014 L、0.021 μg·mL-1。

2.6.2 检测限

取格隆溴铵、杂质1、杂质2、杂质3、杂质4和杂质5的线性贮备液(见“2.5”项)，用稀释剂逐步稀释，当信噪比约为3～5时，即得到检测限溶液，上述各组分的检测限依次为0.017、0.003、0.001、0.008、0.005、0.008 μg·mL-1。

各组分的定量限溶液连续进样6次，峰面积RSD均不超过10%。定量限和检测限浓度均不超过供试品浓度的0.02%，方法灵敏度良好。

2.7 精密度

从同一批均质样品中取6份，用测定6次的结果进行评价，采用加校正因子的主成分自身对照法进行结果计算。取本品适量，照“2.2”项下方法平行配制6份供试品溶液及相应的对照溶液。结果见表3，6份供试品中各杂质含量RSD均不超过10%，总杂质含量RSD为1.42%，说明该分析方法的精密度良好。

表3 精密度

2.8 准确度

用0.9%氯化钠溶液溶解格隆溴铵原料储备液，并用盐酸调节pH至2.8，向该溶液加入杂质限度浓度的50%～150%杂质对照品(最终测定溶液中格隆溴铵浓度为0.2 mg·mL-1)，扣除空白样品中杂质含量后，以测得量与加入量的比值计算杂质回收率。结果(如表4所示)表明：杂质1～5各级别回收率均在99.6%～102.3%之间，其RSD均小于5.0%，符合可接受标准，说明该有关物质分析方法具有良好的准确度。

表4 准确度Tab. 4 Result of Accuracy

2.9 耐用性

耐用性试验分别对柱温(25、35 ℃)、流速(0.9、1.1 mL·min-1)、硫酸加入量(2.7 mL、3.3 mL)和色谱柱(ACE-super C18、Titank C18)进行了研究。结果见表5。结果显示微小改变后各杂质峰之间、杂质峰与主峰之间均有较好分离，对同一批产品检测结果一致，结果表明方法耐用性良好。

表5 耐用性Tab. 5 Result of Robustness

2.10 有关物质测定

用上述已验证完成的方法检测自制的三批格隆溴铵注射液稳定性考察样品，按加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量，各已知杂质、最大未知杂质及总杂质均符合拟定的质量标准，结果见表6。

表6 三批样品测定结果Tab. 6 Results of three batches test sample

3 讨论

查询各药典，暂无格隆溴铵注射液有关物质方法收载。故参考欧洲药典(EP)9.0，USP40版、中国药典2015版格隆溴铵原料标准，在此基础上进行比较优化，并作进一步研究与验证，确定EP 9.0方法更有利于格隆溴铵注射液有关物质检出；通过对已知杂质，及样品破坏中主要杂质紫外吸收波长的扫描，杂质均在210 nm附近有紫外吸收，最终选择和EP 9.0中检测波长一致215 nm。本方法流动相体系中采用的离子对试剂，为保证基线平稳，需选择规格较高的化试，必要时可加预柱，以保护色谱柱。通过方法学验证，结果表明，采用本法测定格隆溴铵注射液的有关物质，操作简便，结果准确可靠，重现性好，专属性强，可用于格隆溴铵注射液的有关物质的质量控制。