油用萝卜籽中黄酮提取工艺优化

朱涵彬，李 靓，董丽鑫

(河南牧业经济学院食品与生物工程学院，河南 郑州450046)

0 引言

萝卜是一种普通的蔬菜，在全国各地均有栽培，萝卜籽是萝卜的成熟种子，别名莱菔子、萝白子和菜头子等，形状呈卵圆形或椭圆形，略扁，表面颜色为黄棕色、红棕色或灰褐色，具有食用价值和药用价值，但并没有得到良好的应用[1]。随着对油料资源的开发，人们逐渐开始重视油用萝卜籽的有效成分研究。近年来有研究表明，萝卜籽粕中含有较为丰富的黄酮类化合物，黄酮是存在于大多数植物体内的一种天然化合物，含有2-苯基色酮结构[2-4]。黄酮类化合物分子式中含有酮式羰基，第1位上的氧原子具碱性，故俗称黄碱素或黄酮。黄酮类化合物因具有降压、降血脂、抑菌、抗炎、抗癌、抗氧化、抗血栓、抗病变、阻止细胞衰老、提高机体免疫力、维护心血管系统和保肝等药理功能，具有很好的开发潜质，受到国内外学者的广泛重视。因此，有必要对萝卜籽中的黄酮化合物进行研究。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

油用萝卜籽品名：超级白美浓；品质：一级；购于武汉市蔬菜科学研究所。芦丁对照品购自合肥博美生物科技有限责任公司。无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠等提取用的溶剂均为国产分析纯，均为天津市科密欧化学试剂有限公司产品。

主要仪器：DGG-9030A型鼓风干燥箱(郑州南北仪器设备有限公司)；HR-08型多功能粉碎机(上海哈瑞斯电器有限公司)；FA1004T型分析天平(厦门雄发仪器仪表有限公司)；VGT-2013QTD型超声波清洗器(250W，广东固特超声股份有限公司)；ROTINA380R型台式大容量冷冻离心机(德祥科技有限公司)。

1.2试验方法

1.2.1工艺流程

样品→干燥→粉碎→称取→浸泡→超声波辅助提取→离心→稀释→定容→样品液→取样测定。

1.2.2绘制芦丁标准曲线

准确称取20 mg芦丁标准品，用60%乙醇溶解，并转移至50 mL容量瓶中稀释至刻度，得到芦丁标准溶液的浓度为0.4 mgmL。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL芦丁对照品溶液于25 mL比色管中，加水至10 mL。在6支比色管中分别加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，振荡摇匀，放置6 min；再分别加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min；最后各加入4%氢氧化钠溶液10 mL，加蒸馏水至刻度线，定容，振荡摇匀后，放置15 min。以空白试剂为对照，在波长为510 nm处测定吸光度值。以标准品的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制芦丁标准曲线[5]。

1.2.3制备样品液

将50 g萝卜籽放入干燥箱中，在100 ℃条件下干燥4 h，然后用粉碎机粉碎，过100目筛，待用。准确称取1 g萝卜籽粉末，置于250 mL锥形瓶中，按一定的料液比加入一定体积分数的乙醇溶液，振荡摇匀，浸泡30 min，在一定温度下，超声提取一定时间后，取出锥形瓶，冷却至室温，再倒入离心管中，以8 000 rmin离心后，将上清液转移至100 mL容量瓶中，用一定体积分数的乙醇溶液定容，即为样品液[6]。

1.2.4单因素试验

分别以料液比、乙醇浓度、超声温度和超声时间为试验因素，设置各因素的不同水平，进行单因素试验，以确定试验因素对萝卜籽提取液中总黄酮提取率的影响。

(1)料液比对总黄酮提取率的影响。

设定乙醇浓度为70%，超声温度为55 ℃，超声时间为30 min，分别以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30和1∶35 gmL的料液比量取相应的乙醇溶液于锥形瓶中。

(2)乙醇浓度对总黄酮提取率的影响。

(3)超声温度对总黄酮提取率的影响。

(4)超声时间对总黄酮提取率的影响。

1.2.5响应面试验

以单因素试验结果为基础，根据Box-Behnken的中心组合设计原则，合理选择因素水平，使用Design-Expert 8.0.6软件设计4因素3水平的试验[7]。

1.2.6测定总黄酮得率

精密吸取5 mL样品液，于25 mL比色管中，按1.2.2方法处理测定，用线性回归方程测定1 g样品中总黄酮的浓度，再用式(1)计算1 g样品中总黄酮得率。

w=cnvm

(1)

式中w——总黄酮得率，mgg

c——样品溶液中黄酮类化合物的质量浓度，mgmL

n——稀释倍数

v——样品液的体积，mL

m——样品质量，g

2 结果与分析

2.1芦丁标准曲线

芦丁标准曲线如图1所示。

2.2单因素试验

2.2.1料液比对总黄酮提取率的影响

料液比对总黄酮提取率的影响如图2所示。

从图2可以看出，随着料液比的增加，萝卜籽中黄酮类化合物的提取量先增加后减少。当料液比小于1∶25 gmL时，黄酮含量随料液比的增加而增大；当料液比为1∶25 gmL时，黄酮含量最高；当料液比大于1∶25 gmL时，黄酮含量逐渐降低。这可能是因为在一定料液比范围内，增加料液比有利于增加活性成分与溶剂的接触机会，扩大组织体系中的浓度差，活性成分更容易溶解[8]。当料液比增加到一定量的时候，有效成分的溶解达到了一种动态平衡，乙醇溶液将黄酮基本溶解出来，提取含量不再增加。如果继续增大料液比，可能会使一些醇溶性物质溶解，从而干扰黄酮提取含量的测定，导致黄酮含量下降，并且造成试剂的浪费。因此最佳的料液比为1∶25 gmL。

2.2.2乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

乙醇浓度对总黄酮提取率的影响如图3所示。

从图3可以看出，在一定乙醇浓度范围内，萝卜籽中黄酮类化合物的含量随乙醇浓度的增加先升高后降低。当乙醇浓度<70%时，提取量随乙醇体积分数的增大而增加；当乙醇浓度为70%时，提取量最高；当乙醇浓度>70%时，提取量减少。这可能是因为在一定的溶剂浓度范围内，溶剂浓度的增加有利于溶剂与原料的充分接触，使黄酮类化合物的含量增加。当达到一定浓度，黄酮的含量达到最高；再增加溶剂浓度，导致干扰性杂质溶出，对黄酮含量的测定造成影响。因此乙醇的最佳浓度为70%。

2.2.3超声温度对总黄酮提取率的影响

超声温度对总黄酮提取率的影响如图4所示。

从图4可以看出，随着超声温度的升高黄酮类化合物的含量先升高后降低。当超声温度<55 ℃时，黄酮含量随温度升高而增加；当超声温度达到55 ℃时，黄酮含量最高；当超声温度>55 ℃时，黄酮含量减少。这可能是因为一定温度范围内，温度越高，分子运动速率越快，使体系内反应速率加快，溶液扩散、渗透和溶解地较为彻底，黄酮类化合物更容易从细胞中转入到溶剂中。但是当温度上升到一定程度的时候，一些黄酮类化合物可能会降解和破坏，从而导致含量下降。因此，最佳超声温度为55 ℃。

2.2.4超声时间对总黄酮提取率的影响

超声时间对总黄酮提取率的影响如图5所示。

由图5可知，随着超声时间的增加，黄酮含量先增加后减少。当超声时间<30 min时，黄酮含量随超声时间增加而增加；当超声时间为30 min时，黄酮含量最高；当超声时间>30 min时，黄酮含量略有下降。这可能是因为超声时间越长对黄酮类化合物的溶解越有利，但当时间长到一定程度，再延长时间，超声产生的空化效应和振动作用，会导致黄酮化合物的降解，测定含量偏低。因此，最佳超声时间为30 min。

2.3响应面优化试验设计及结果分析

2.3.1响应面优化试验设计

根据单因素试验结果，响应面试验因素和水平如表1所示。响应面设计及结果如表2所示。

表1 响应面试验因素和水平表

表2 响应面设计及结果

2.3.2数据模型的建立及回归方程的方差分析

使用Design-Expert 8.0.6软件对表2的数据进行二次多元拟合处理后，得到回归方程为

黄酮总量=15.00+0.24A+0.10B-0.53C-0.35D+0.65AB+0.62AC+0.14AD+0.32BC+0.48BD-0.10CD-1.04A2-2.20B2-0.61C2-0.71D2

(2)

式中A——料液比，gmL

B——乙醇浓度， %

C——超声温度， ℃

D——超声时间， min

所得的方差分析如表3所示。

表3 方差分析

根据表3，模型F=9.30，P<0.000 1，表明二次回归方程模型极显著[9]。失拟项F=1.19，P=0.468 9，不显著，说明二次回归方程拟合度较高，用于计算结果是有意义的。

表3中，二次项A2和B2，P<0.001，极显著；C和D2，P<0.01，高度显著；AB、C2显著。通过响应面分析得出对黄酮提取含量影响的大小顺序为超声温度>超声时间>料液比>乙醇浓度。

使用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行分析得出，料液比、乙醇浓度、超声温度和超声时间4个因素之间两两相互作用对黄酮提取含量影响情况，如图6～11所示。

2.3.3最佳工艺检验

油用萝卜籽中总黄酮提取工艺的最佳条件：超声温度53 ℃，超声时间28 min，料液比为1∶25 gmL，乙醇浓度为70%，此时提取率最高，萝卜籽中总黄酮的提取含量为15.15 mgg。

经过3组平行试验，证明应用上述最佳提取工艺条件，实际油用萝卜籽中总黄酮的平均提取含量为15.18 mgg，与软件预测值接近，证明最佳工艺预测值较准确[10-11]。

3 结论

通过分析料液比、乙醇浓度、超声温度和超声时间4个因素及两两因素间对总黄酮提取含量的影响，得出各因素对提取含量影响大小的顺序为超声温度>超声时间>料液比>乙醇浓度。当料液比1∶25 gmL，乙醇浓度70%，超声温度53 ℃，超声时间28 min时，提取率最高，此时总黄酮含量为15.18 mgg，与模型预测值15.15 mgg接近，表明此工艺较为可靠，有一定的参考价值。