白细胞介素-6 受体及其基因突变与慢性阻塞性肺疾病相关性研究

李俏俏 郑 静 徐婷婷

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）被定义为可预防和治疗的疾病，伴有严重的肺外作用，增加患者的严重程度风险[1-2]。白细胞介素-6 受体（interleukin-6 receptor，IL-6R）是一种模式识别受体，可与微生物表面的抗原特异性结合，从而激活补体系统。IL-6R 与COPD 急性加重相关。研究表明，IL-6R 基因编码和启动子区域的单核苷酸多态性对血清IL-6R 水平有功能影响，IL-6R 基因突变型AA 与儿童呼吸道感染频率、早期感染发作及成人系统性红斑狼疮、高侵袭性肺炎球菌感染密切相关[3-4]，而携带IL-6R 变异等位基因型GG的儿童在化疗期间出现发热性中性粒细胞减少症[5]。目前关于IL-6R 及其基因突变与COPD 相关性研究较少。本研究拟探讨IL-6R 基因突变型与COPD 的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取浙江省台州市立医院呼吸内科2018 年3 月—2019 年10 月确诊COPD 患者78 例为COPD 组，肺功能分级[6]：Ⅱ级42 例，Ⅲ级19 例，Ⅳ级11 例，Ⅴ级6 例。另取浙江省台州市立医院门诊健康体检者134 名作为对照组，对照组受试者肺活量测定正常。本研究经医院伦理委员会审核通过（审批号：伦审字2018-0029），所有受试者均签署知情同意书。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：（1）均符合COPD诊断标准[7]，无支气管扩张、支气管哮喘、肺癌、肺结核等其他呼吸系统疾病；（2）临床资料完整。排除标准：（1）孕妇，近3 个月有手术、创伤史；（2）严重心血管疾病；（3）糖尿病、自身免疫性疾病、消化道和泌尿系统等其他感染。

1.3 主要试剂及仪器 TRIzol 试剂盒（美国Invitrogen 公司，批号15596026）；PrimeScript 逆转录（RT） 试剂盒（宝生物工程大连有限公司，批号RRO37A）；EPS-100 型电泳仪（上海天能科技有限公司）；7500 型荧光定量聚合酶链反应仪（美国ABI 公司）；BTL-08 SPIRO 型肺功能测量仪（英国比特勒公司）。

1.4 IL-6R 基因rs4845617 单核苷酸多态性检测根据说明使用TRIzol 试剂盒分离血液总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳确定RNA 的完整性。使用PrimeScript 逆转录（RT）试剂盒将RNA 逆转录成cDNA，并将产物保存在冰箱中以进行下一步的实验。采用荧光定量聚合酶链反应仪扩增靶基因。IL-6R 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。IL-6R 上游引物：5'-TGTGAGTCGGAGAGGCTGTGACTG-3'；下游引物：5'-CGTAACTGATTCCTCGTGACTACC-3'。探针（C）：5'-VIC-TGTGTGCGTAACTGGCGGTGC-MGB-3'；探针（T）5'-FAM-CTGGACTGACCGT-MGB-3'；所有反应设置3 个重复孔。以3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内部参考，通过相对定量（2-ΔΔCT 方法）计算倍数变化。PCR 条件是在94℃初始变性3min；在55℃退火，在72℃延伸35 个循环，最后在72℃延长7min，重复40 个循环，61℃时采集荧光。连接酶检测技术检测SNP。目的基因及内参基因的2%琼脂糖凝胶电泳（见图1）。变性梯度凝胶电泳检测IL-6R 基因的rs4845617 单核苷酸多态性（见图2）。IL-6R 基因第6 外显子-32G/A 正向位点测序图，见图3。

1.5 COPD 患者肺功能指标测定 肺功能测量仪测定患者静息状态下用力肺活量（FVC）、一秒钟用力呼气容积（FEV1）、最大呼气中段流量（MMEF）。

图1 目的基因及内参基因2%琼脂糖凝胶电泳

图2 IL-6R 基因变性梯度凝胶电泳

1.6 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（） 描述，采用t 检验和单因素方差分析比较，多重比较采用SNK-q 检验；计数资料以例数和百分比（%）描述，采用χ2检验比较；多态性位点的基因型与易疗效的风险分析采用二元Logistic 回归分析，以OR 及95%CI表示相对风险度，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组与COPD 组一般资料比较 两组受试者一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。见表1。

2.2 对照组与COPD 组IL-6R rs4845617 各基因型突变型比较 与对照组比较，COPD 组IL-6R rs4845617 AA 基因型比例升高，GG 基因型比例降低（P＜0.05）；与IL-6R rs4845617 AG、GG 基因型比较，IL-6R rs4845617 AA 基因型COPD 易感性明显增加（OR=2.418、95% CI=1.748～3.345，P＜0.05）。见表2。

表1 对照组与COPD 组一般资料比较

表2 对照组与COPD 组IL-6R rs4845617 各基因型突变型比较[例（%）]

2.3 对照组与COPD 组IL-6R rs4845617 各等位基因突变频率比较 与对照组比较，COPD 组IL-6R rs4845617 A 等位基因频率比例升高，IL-6R rs4845617 G 等位基因频率比例降低（P＜0.05）；IL-6R rs4845617 G 等位基因频率比较，IL -6R rs4845617 A 等位基因频率COPD 易感性增加（OR=2.911、95% CI=2.220～3.818，P＜0.05）。见表3。

表3 对照组与COPD 组IL-6R rs4845617 各等位基因突变频率比较[例（%）]

2.4 COPD 患者各基因组肺功能指标比较 COPD组AG、GG 型FEV1、FEV1/FVC、MMEF 水平高于AA型，差异有统计学意义（P＜0.05）；GG 型FEV1、FEV1/FVC、MMEF 水平高于AG 型，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

图3 IL-6R 基因第6 外显子-32G/A 正向位点测序图

表4 COPD 患者各基因组肺功能指标比较（）

表4 COPD 患者各基因组肺功能指标比较（）

注：COPD 为慢性阻塞性肺疾病；FEV1 为一秒钟用力呼气容积；FEV1/FVC 为一秒钟用力呼气容积/静息状态下用力肺活量；MMEF为最大呼气中段流量；与AA 型比较，aP＜0.05；与AG 型比较，bP＜0.05

2.5 COPD 患者AA 基因型与疾病严重程度相关分析 随着COPD 病情严重程度逐渐增加，AA 基因型比例逐渐升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 COPD 患者AA 基因型与疾病严重程度相关分析[例（%）]

3 讨论

IL-6R 的突变基因型与成人和儿童呼吸道感染风险增加有关[8]。IL-6R 的外显子中的三个多态型由230AA（密码子54B 等位基因），239AG（密码子57C等位基因）和223GG（密码子52D 等位基因）组成，这些等位基因的单倍型在IL-6R 的启动子区域具有变异，特别是在位置≥32（A/G 等位基因）[9-11]。IL-6R 在结构多态性和某些启动子单倍型之间观察到连锁不平衡，并且外显子多态性可能对血清白细胞介素-6（IL-6）水平具有更大的影响。临床研究证实，“高生产者等位基因”IL-6R rs4845617 AA 患者会发生免疫学炎症性疾病，例如炎症性肠病、类风湿关节炎和系统性红斑狼疮[12]。IL-6R 启动子区域AA 等位基因倾向与脂多糖刺激的IL-6 产生增加有关。携带AA等位基因的儿童在感染呼吸道合胞病毒后细支气管炎的发生率明显高于其他基因型儿童，而严重呼吸道合胞病毒（RSV）感染是COPD 发生的危险因素[13]。本研究发现，与对照组比较，COPD 组IL-6R rs4845617 AA 基因型比例升高，IL-6R rs4845617 AA 基因型COPD 易感性增加（OR=2.418、95%CI=1.748～3.345，P＜0.05）。表明，IL-6R rs4845617 AA 基因型与COPD 易感性相关。

研究观察到，脂多糖刺激后IL-6R rs4845617 A表达增加[14]。在本研究中，与对照组比较，COPD 组IL-6R rs4845617 A 等位基因频率比例升高，IL-6R rs4845617 A 等位基因频率COPD 易感性增加（OR=2.911、95%CI=2.220～3.818，P＜0.05），也说明IL-6R rs4845617 A 等位基因在COPD 患者中更为常见。

研究发现，IL-6R 等位基因与COPD 和哮喘相关，这一发现支持这样的观点，即虽然哮喘和COPD是不同的疾病，但至少部分遗传易感性可能是相同的[15]。通过对染色体2q 上的IL-6R 区域在全基因组进行筛选，结果显示，AA 型基因能降低FEV1、FEV1/FVC、MMEF 水平，GG 型基因能升高FEV1、FEV1/FVC、MMEF 水平。本研究结果也发现，随着慢性阻塞性肺疾病严重程度逐渐增加，AA 基因型比例逐渐升高，这提示AA 基因型可能加重COPD 严重程度。研究表明，同一地区哮喘患者IL-6R rs4845617 AA 型患者具有较高水平的血清总免疫球蛋白E（IgE）水平，而血清总IgE 水平已被证实与哮喘和支气管高反应性有关[14]。结合本次研究结果，推测COPD 严重程度增加可能与IL-6R 基因突变型AA 导致的高水平IgE 有关。然而，这种推测不能排除其他候选基因位点，并且这种关联可能是由于存在连锁不平衡的不同易感基因导致。为排除这种偏倚，需要更多的样本量，这将在后续研究进行。

综上所述，IL-6R rs4845617 基因突变型AA 能增加慢性阻塞性肺疾病的易感性。