面向培养科研能力的研究与创新实验设计与实践

靳 明， 景雪拳， 韦丽红， 白国义， 杨瑜涛

（河北大学a.化学国家级实验教学示范中心；b.化学与环境科学学院，河北保定071002）

0 引 言

实验教学是高等教育中的重要实践教学环节，是培养学生创新能力、实践能力和综合素质的重要教学手段［1-2］。化学是一门以实验为基础的学科，实验教学在学生培养方案中占有非常高的比例。化学实验教学对于学生的知识、能力、思维和素质的协调发展起着至关重要的作用，在整个化学教育教学过程中占有特殊的地位。传统的实验教学是学生按照教科书提供的实验方案，在教师的指导下完成实验，能够培养学生的基本实验技能，但实验内容与科研前和实际应用联系较少，学生的创新实践能力和综合能力得不到充分的锻炼和提高。研究与创新实验是集多学科性、创新性、研究设计性和综合性实验技能于一体的实验课程，不仅培养学生实验操作技能，关键是缩小学生所学专业基础知识与科研、生产实践中解决实际问题能力之间的差距，达到增强学生科研能力、实践能力和创新能力的目标。因此，当前在高校积极开展研究与创新实验尤为必要，国内诸多高校也在此思路上进行了探索和实践［3-12］。

1 实验设计思路

香豆素是一类常见的荧光染料，合成方法简便，荧光团易于修饰，波长范围易于拓展，量子产率高，已广泛应用于荧光探针领域。在前期工作的基础上［13-15］，利用8-羟基久洛尼定和苯并噻唑的刚性平面结构增强了香豆素的荧光母体探针的平面性，设计了一种新的香豆素-苯并噻唑荧光探针，并以此开展本科生研究与创新实验。整个实验过程如下：①通过4 步有机合成反应制备探针分子，合成路线如图1 所示。4 个不同反应涉及有机反应中的不同化学反应，学生可利用已掌握的知识或是查阅文献的方式了解其反应机理，利用SciFinder查找反应路线，不同组的同学尝试不同的反应路线，最后对比了解最佳方式；②对探针分子进行分离、纯化与表征；③对探针分子的紫外和荧光光谱性质进行分析探讨。整个实验过程中，学生不仅学习巩固了有机化学和波谱学理论知识，学会了抽滤、萃取和硅胶色谱柱等有机化学基本操作，还掌握了仪器分析化学中的紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪等仪器的使用和Origin 等数据处理方法。另外，此实验还可以通过探针溶液前后颜色变化，把实验现象和光谱的理论知识结合起来，让学生更直观地观察到实验现象变化，教学效果良好，有利于激发学生的学习科研兴趣，提高科研创新能力。

图1 探针分子的合成路线

2 实验目的和实验试剂、仪器

2.1 实验目的

通过文献检索，学会中外数据库的使用，了解香豆素衍生物荧光探针的研究进展、合成方法以及应用前景；掌握加热、过滤、重结晶、萃取、柱层析等基础的合成实验方法操作和技能；掌握缩合、成环、卤化、氧化等经典有机反应，并能进行一些简单的探针设计；熟练磁力搅拌器、旋转蒸发仪、紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪等仪器的操作；了解核磁共振仪和质谱仪的检测原理；学会核磁、质谱、紫外和荧光等仪器使用及Origin等数据处理和图谱分析方法；培养学生独立分析和解决问题的能力，提高学生的科研创新能力。

2.2 实验仪器和试剂

仪器：茄形瓶、磁力搅拌器、油浴盆、层析柱、蛇形冷凝器、锥形瓶、电子天平、循环水真空泵、旋转蒸发仪、AVANCE Ⅲ型核磁共振仪（瑞士布鲁克），Cary 60型紫外-可见分光光度计（美国安捷伦），Cary Eclipse型荧光光谱仪（美国安捷伦）。

试剂：苯酚、丙二酸、三氯氧磷、哌啶、甲苯、8-羟基久洛尼定、正己烷、氢氧化钠、N，N-二甲基甲酰胺（DMF），氯化钠、乙腈、无水乙醇、苯并噻唑盐、无水硫酸钠、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氯仿、二甲基亚砜（DMSO）、丙酮、不同阴离子溶液、GSH、Hcy、Cys。

3 实验实施步骤

3.1 化合物2 的合成

在150 mL圆底烧瓶中加入苯酚（10.6 mmol，1.00 g）和丙二酸（5.3 mmol，0.55 g），接着向其中慢慢加入POCl3（6.15 mmol，0.58 mL），在0 ℃下搅拌30 min，慢慢将混合物加热至120 ℃，直至没有HCl气体生成后，将混合物冷却至室温，将反应物倒入100 mL 水中，用乙酸乙酯萃取3 次，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥后浓缩得到白色固体化合物2（1.12 g，产率87.5%）。

3.2 化合物3 的合成

将化合物2（4 mmol，1.02 g）置于100 mL圆底烧瓶，加入甲苯（10 mL）溶解，接着加入8-羟基久洛尼定（4 mmol，0.75 g），在110 ℃下搅拌回流10 h，冷却至室温，过滤，正己烷洗涤多次得到化合物3（0.94 g，产率91.2%）

3.3 化合物4 的合成

在N2保护下，将POCl3（3 mL）慢慢滴加到无水DMF（3 mL）中，室温搅拌30 min，得到红色液体。将红色溶液逐滴加入到化合物3（3.5 mmol，0.90 g）的DMF（5 mL）溶液中，60 ℃下搅拌10 h后，将反应液倒入50 mL 水中，用30%的NaOH 溶液将溶液调节至pH ＝5，有大量红色沉淀产生，过滤，将粗产品进行柱层析分离提纯（PE∶EA ＝1∶1）得到红色固体化合物4（0.76 g，产率72.2%）。

3.4 探针的合成

将化合物4（1. 0 mmol，0. 30 g）和苯并噻唑盐（1.1 mmol，0.31 mg），用无水乙醇（25 mL）溶解，加热回流搅拌12 h，将反应液冷却至室温，抽滤得到固体，用无水乙醇充分洗涤，得到探针化合物1（0.37 g，产率83%）。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ8. 33（d，J ＝7.8 Hz，1H），8.17 ～8.23（m，2H），8.03（d，J ＝15.0 Hz，1H），7.82（t，J ＝15.6 Hz，1H），7.73（t，J ＝15.0 Hz，1H），7.41（s，1H），4.18（s，3H），3.42（d，J ＝5.4 Hz，4H），3.72 ～3.77（m，4H），1.88 ～1.91（m，4H），13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ 157.9，151.1，149.9，149.8，146.7，142.1，139.9，129.3，128.1，127.4，124.2，124.1，121.6，116.5，112.9，107. 9，107. 1，104. 9，50. 0，49. 4，35. 9，26.8，20.3，19.5，19.3。

4 结果与讨论

4.1 紫外可见吸收光谱分析

图2 探针分子（10 μmol／L）对阴离子及小分子生物硫醇（100 μmol／L）的响应的紫外光谱图

4.2 荧光光谱分析

如图3 所示，在DMF-PBS（v／v ＝1／10，PBS，10 mmol／L，pH 7.4）缓冲溶液中，利用荧光光谱分析了探针分子对上述分析物的识别性能。选择等吸收点470 nm 为激发波长，荧光探针在665 nm 处有强的发射波长，当加入时，762 nm处荧光减弱，556 nm有强的荧光发射出现，溶液的荧光颜色由紫红色变为绿色，其他分析物并未发生明显变化，结果表明，荧光探针对识别有高选择性。

图3 探针分子1（4 μmol／L）对阴离子及小分子生物硫醇（40 μmol／L）的响应的荧光光谱图（激发波长为470 nm，狭缝：10 nm／10 nm）

图4 的荧光滴定图

最后，利用荧光光谱研究了pH 值对探针分子识别性能的影响。如图5 所示，探针分子在pH 3 ～11 范围内，I665nm／I556nm没有明显变化，说明探针分子有良好的耐酸碱性，比较稳定，随着的加入，发现I665nm／I556nm在pH 6 ～11 范围内发生明显变化，表明探针分子在较宽的pH 值范围内，可实现对范围内的识别检测。

图5 pH值对探针荧光强度的影响

5 结 语

通过香豆素—苯并噻唑荧光探针的设计、合成及对亚硫酸氢根的检测实验，学生掌握了大量的有机化学和波谱学理论知识，尤其经过最初的设计、理论论证、实践实验检验反馈、再次理论指导设计、实验再检验等理论实践相互交替轮流验证中，学生理论知识得到进一步提高，实验结果又进一步验证理论知识，提高了分析问题解决问题的能力。通过不断地实验和仪器的使用及数据的处理，增强了学生的动手能力。查找诸多有机反应机理，更是让学生亲身体会到理论到实际再到理论的过程。

近年来，受该实验启发，学生求知欲和自主探究问题能力增强。作为本科生，设计了诸多新颖荧光探针，如识别室内甲醛、环境中硫化物、水中重金属离子和生物体内小分子硫醇等，并多次成功申请到大学生创新创业项目、实验室开放项目及发表科研论文［15-16］，提高了学生的科研能力和创新能力。