探究式实验教学设计和探讨：猜猜它是谁？——3T3-L1 和L929 细胞的增殖测定

潘 倩

（四川大学华西基础医学与法医学院，成都610041）

0 引 言

细胞培养是包括医学在内的生命科学领域最重要、最基础的实验技术之一，它在生命科学领域的应用十分广泛，是学生今后从事专业相关工作所必须掌握的一门实验技能［1］。在细胞培养的实验教学中，如何吸引学生的兴趣、激发学生求知的欲望，使其在短时间内掌握相关操作等这些问题给实验教师提出了很大的挑战［2］。为此，在探究式学习的理论基础上，利用3T3-L1 和L929 两种细胞在不同培养条件下增殖水平的差异，设计了“猜猜它是谁？——3T3-L1 和L929 细胞的增殖测定”这一综合性与研究性实验，以期激发学生的学习主动性和积极性，锻炼学生的科研思维［3］，使其牢固掌握相关实验技能，切实提高学习效果和实验教学水平［4］。

1 教学设计

1.1 情境设计

①创设情境。老师告知学生现在实验室有2 种连续细胞株，3T3-L1（小鼠脂肪前体细胞）和L929（小鼠结缔组织成纤维细胞），但由于在细胞冻存时只对两种细胞标记了A、B，并未写具体名称，已不能确认A和B具体是哪种细胞。②给出线索（见表1）。③启发思考。老师提出问题，请大家根据已知线索，设计不同的培养条件，通过对A、B 两种细胞的增殖测定，猜猜它是谁？

表1 3T3-L1 细胞和L929 细胞的说明

1.2 教学目的

通过此实验的学习，使学生①了解体外培养环境中成纤维样细胞和上皮样细胞的形态特征；②熟悉细胞冻存与复苏的操作方法；③掌握无菌技术；④掌握细胞传代技术；⑤掌握倒置显微镜观察体外培养细胞的使用方法；⑥了解细胞计数方法；⑦掌握台盼蓝拒染法计数活细胞；⑧了解细胞增殖测定方法；⑨掌握MTT法检测细胞增殖［5-6］。

1.3 教学重点与难点

该探究式实验教学项目的教学重点是无菌技术、细胞传代技术、倒置显微镜的使用、台盼蓝拒染法计数活细胞、MTT法检测细胞增殖。教学难点是学生要根据已知线索，自行设计实验方案，通过对实验结果的分析得出结论，这增加了实验的趣味性和探索性。

1.4 教学安排

该探究式实验教学项目的教学内容与学时安排见表2［7］，共计15 学时，分3 次进行，其中第1 次与第2次的时间间隔不低于24 h，“细胞增殖测定”实际操作只需2 学时，其余6 学时为细胞孵育和甲臜结晶溶解所需时间，不同高校可根据各自的教学要求对学时做适当调整。可根据细胞培养室的实际使用面积将学生分组，建议2 或3 人为1 小组，小组内成员协调分工与合作，共同完成实验任务［8］。

表2 教学内容与学时安排

1.5 考核评价

充分贯彻全过程考核和非标准答案考试，成绩构成［9］见表3，其中实验操作和实验方案与结果的汇报作为平时成绩占总成绩的80%；实验报告是在所有实验完成后，将3 次实验的内容整合形成1 篇综合性实验报告。

2 教学内容

2.1 实验材料与仪器设备

所需实验材料有：3T3-L1 细胞和L929 细胞（中国科学院昆明细胞库），Dhanks（无钙镁离子，Solarbio），胰蛋白酶溶液（0.25%，Hyclone），DMEM 培养液（高糖，Gibco），新生牛血清（new-born bovine serum，NBCS，Gibco），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，中乔新舟），台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒（碧云天），MTT细胞增殖检测试剂盒（碧云天），96 孔细胞培养板，不同规格的枪头、离心管等。所需仪器设备有：超净工作台，CO2培养箱，恒温水浴锅，移液器，血细胞计数板，离心机，倒置显微镜，酶标仪等。

2.2 实验步骤

（1）细胞传代。打开超净工作台紫外灯，灭菌30 min，然后关闭紫外灯，打开超净工作台鼓风机；在恒温水浴锅中37 ℃预热DHanks液、胰蛋白酶溶液、DMEM培养液。在无菌超净工作台中，严格无菌操作，首先配制完全培养液，如90% DMEM ＋10% NBCS、90%DMEM ＋10%FBS；然后分别将A、B 两种细胞的培养液去除，加入适量DHanks 液，清洗2 次；接着将DHanks液弃去后，加入适量胰蛋白酶，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若大部分细胞变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加适量完全培养液终止消化。吸取培养瓶内的液体冲洗贴壁细胞，得到细胞悬液，轻轻混匀后取适量进行活细胞计数。

（2）活细胞计数。吸取50 μL细胞悬液，加入50 μL台盼蓝染色液（2 ×），轻轻混匀，染色3 min（不宜超过10 min）。取细胞计数板，在计数区盖上一块边缘经轻轻润湿的盖玻片，将经染色的细胞混匀，吸取20 μL滴加在盖玻片边缘，使细胞悬液通过毛细管作用充满盖片和计数板之间，去除多余液体（不要吸走盖玻片下方的液体），将计数板置于显微镜下，在10 ×物镜下采用“计上不计下，计左不计右”的原则计数中央大方格内未被染色的活细胞，计数重复2 次，然后计算活细胞密度：活细胞密度（个／mL）＝未被染色的平均细胞数×104［10］。

（3）不同条件下的细胞接种培养。按自行设计的细胞培养方案将计数后剩余的细胞悬液平分，离心（1 000 r／min，5 min），去除上清，分别加入适量不同的完全培养液，混匀后分别向96 孔培养板中每孔加入约5 000 个活细胞，随后加入相应的完全培养液至100 μL。每种培养条件设5 个复孔，随后放入37℃、5%CO2培养箱中静置培养。

表3 考核评价表

（4）细胞观察。打开电源，将灯光强度从最低开始调至合适强度，将培养板放置在倒置显微镜载物台上，左右移动载物台使光源对准待观察细胞，选择合适倍数物镜（一般由低倍到高倍），双眼从目镜中观察，转动调焦旋钮至细胞清晰。

（5）细胞增殖测定。向每个培养孔内加入10 μL MTT溶液（5 mg／mL），在CO2培养箱内继续孵育4 h。每孔加入100 μL Formazan 溶解液，适当混匀，在CO2培养箱内再继续孵育，直至在普通光学显微镜下观察发现紫色结晶即甲臜全部溶解（溶解时间与结晶量有关，一般为3 ～4 h）。随后用酶标仪在检测波长（570 nm）和校正波长（630 nm）下测定各孔吸光度。

（6）统计学分析。采用SPSS 19 软件进行统计学分析，所有数据均用¯x ±s 表示，组间比较采用单因素方差分析［11］。P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 实验结果与分析

3.1 不同培养条件下3T3-L1 细胞和L929 细胞的增殖

在相同细胞接种量的情况下，接种3 d 后3T3-L1和L929 两种细胞在不同培养条件下的OD 值（OD570-OD空白对照570平均值-OD630＋ OD空白对照630平均值）如表4 所示。其中3T3-L1 细胞在DMEM ＋10%NBCS和DMEM ＋10%FBS培养条件下的OD值有统计学差异（P ＜0. 05），L929 细胞在DMEM ＋10% NBCS 和DMEM ＋10%FBS 培养条件下的OD 值无明显差异。在此实验基础上可推断A、B各为哪种细胞。

表4 接种3d后3T3-L1 和L929 两种细胞在不同培养条件下的OD值

3.2 实验注意事项

（1）活细胞计数时，盖玻片的边缘要盖住计数板最外边的凹槽。盖玻片和计数板之间应呈现牛顿环，这样盖玻片才算平整地盖到计数板上，计数小室的深度仅为1 mm。往计数小室注入的细胞悬液不要太多，也不要太少，否则由于表面张力的变化会改变小室的容积，细胞悬液流到凹槽边缘即可［10］。

（2）MTT法检测细胞增殖时，终止培养时细胞数量不应过多，以防影响甲臜产生的量与细胞数量间的良好线性关系（OD 值在0.2 ～0.8 之间误差较小）。MTT法检测细胞增殖，每次实验均应设置与实验孔平行的空白对照，即除了不含细胞外其他条件相同的对照孔，最后比色时以对照孔调零。由于使用96 孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题，一方面，由于96 孔板周围1 圈最容易蒸发，可以采取弃用周围1 圈的办法，改加平衡盐溶液、水或培养液；另一方面，可以把96 孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

4 实验教学探讨

4.1 开设探究性实验教学项目的意义

细胞的增殖测定是具有普适性的细胞培养核心操作，培养学生掌握此实验操作十分必要。传统的实验教学，一般采取“老师现场演示讲解，学生依照教材摸索操作”的模式［12］，其教学效果往往不尽人意，究其原因，大多在于对学生学习主体地位的漠然以及对学生自主学习能力培养的忽视［13］。这就导致学生在习惯被动接受老师知识的情况下进入实验室，操作停留在对老师现场演示讲解的机械模仿、对实验教材的盲目迷信阶段，学生缺乏主动获取知识的意识与能力，这显然不利于他们掌握实验技能、锻炼能力素质。该探究式教学实验项目，注重学生在学习过程中的主体地位，在围绕知识点所创设的特定情境之下，通过老师的启发、引导与支持，学生带着问题开展自主性学习［14-16］，从而达到对知识技能的深入理解与掌握，对综合素质的切实锻炼与提高。

4.2 实验项目的特色

该教学实验项目，将探究式教学方法应用于细胞的增殖测定，教学活动的主体由老师转移到学生，围绕学生的自主知识构建，综合运用主动学习、合作学习、探究式学习、基于问题的学习等多项教学策略，充分调动学生的学习积极性和主动性，通过培养学生的专业技能和综合能力，促进学生的优质学习和全面发展。

4.3 实验安排的可行性

该探究式实验项目制定了详细的操作流程，并经过实验老师反复验证，实验结果重复性高。实验中使用的3T3-L1 细胞和L929 细胞为常见细胞株，价格低廉，且易于培养。涉及的实验技术有：无菌技术、细胞传代技术、倒置显微镜的使用、台盼蓝拒染法计数活细胞、MTT 法检测细胞增殖等细胞培养实验，一般高校均开设有相关的细胞培养实验课程，可操作性强。

4.4 实验的推广与应用

能否顺利开展此实验项目，首先要求实验室具备3T3-L1 细胞和L929 细胞，也可参考此文思路，利用已有的细胞株自行设计相关探究式教学实验项目。其次实验室需具备细胞培养常规的仪器设备，其中若实验室未配备酶标仪，可根据现有的实验设备，修改教学安排，如改用直接计数法检测细胞增殖。最后特别要求实验老师在熟练掌握相关实验技术的同时，能够有效地启发、引导与支持学生的探究式学习。因此，该探究式教学实验项目可在具备以上条件的高校参考试行。

5 结 语

该教学实验，改变了传统实验教学中学生被动消极的学习状态，使学生以主动积极的姿态成为学习的主体；而老师则由指导变为引导，由讲授变为启发，并起总结深化的作用。这有效解决了传统实验教学存在的诸多问题，变革了传统的实验教学模式，是改进实验教学的一次全新探索。