ND-IBD 二联灭活疫苗与IBD 活疫苗免疫商品蛋鸡的效果比较

屈贵蜀，黄瑞玲，星 东，彭瑶顺，庄许诺，许丽惠，江兴华，王全溪

（1.福建农林大学动物科学学院（蜂学学院），福建 福州 350002；2.福州大北农生物技术有限公司，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意义】随着我国农业的发展，畜禽养殖规模不断扩大，造就了越来越密集的养殖条件，传染病发生的风险也随之被加大。近几年传染性法氏囊病（Infectious bursal disease, IBD）与新城疫（Newcastle disease，ND）这两种病在养鸡产业中经常发生，并且给世界养禽业带来巨大的经济损失[1-2]。通过对两种疫苗的免疫效果比较可以为二者的安全合理使用提供数据基础。【前人研究进展】研究表明，预防该两种传染病的方法依然是疫苗接种，对于该病的预防，一般采用常规疫苗进行免疫接种，但也有一些是通过改进后的特定的疫苗进行免疫[3-4]。弱毒活苗容易被母源抗体中和，引起免疫失败。虽然中强毒力及中等偏强毒力的IBD 与ND 活苗可以突破母源抗体的干扰，但会对雏鸡法氏囊造成损伤，引起法氏囊萎缩导致免疫抑制[5]。疫苗免疫使机体内产生细胞免疫，T 淋巴细胞被激活引起免疫器官中细胞因子水平的变化；CD4 和CD8 T 淋巴细胞数量，可以作为体内免疫状态的标准。陆吉虎等[6]研究表明疫苗会有效提高机体内免疫因子T 细胞CD4+、CD8+T、IL-4 等分泌。白细胞介素（Inter leukin, IL）是免疫调节的重要细胞因子。IL-6 在调节免疫应答方面具有重要影响意义[7]，它能促进T 细胞和B 细胞增殖、分化并产生抗体。【本研究切入点】活苗免疫存在诸多安全问题，研究发现有些活苗免疫会因免疫个体抗体水平不一致导致毒株变异，严重的情况下会引起疫病爆发造成巨大经济损失。灭活疫苗对IBD 与ND 具有很好的免疫效果，且安全性高。ND-IBD 二联灭活苗在诸多方面进行了改进，它的改进能避免常规活苗的缺陷。所以，比较ND-IBD 二联灭活苗与IBD 活疫苗在商品蛋雏鸡的免疫效果及机体对该疫苗的免疫反应是一个值得研究的方向。【拟解决的关键问题】为比较分析ND-IBD 二联灭活苗与IBD 活苗的免疫效果，将两种疫苗分别对同日龄商品蛋鸡进行免疫，免疫后每周检测IBD 抗体水平和免疫器官中基因CD4+、CD8+、IL-6 mRNA 表达量，且进行攻毒保护试验，为NDIBD 二联灭活苗的免疫效果及其实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验动物：120 羽1 日龄商品蛋鸡购自福州某鸡场，该鸡场中种鸡免疫水平NDV 和IBDV 均属于正常抗体水平。经检测，1 日龄的NDV 抗体水平为（6.40±1.34）log2，且差异不显著；IBDV 抗体水平为（12.30±0.46）log2，且差异不显著。强毒株IBDV（BC6-85株）、ND-IBD 二联灭活苗（LaSota+HQ 株）与IBD活苗，由福州大北农生物技术有限公司提供；IBDV抗原和标准阳性血清；PBS 液；96 孔v 型微量反应板；Marker 购自Thermo Scientific 公司；TransZol UP Plus RNA Kit 的RNA 提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；GoScriptTMReverse 反转录试剂盒以及qPCR 所需的荧光试剂盒均购自厦门泰京生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组 选取体重、健康水平相近的1 日龄商品蛋鸡120 只，分成A、B、C 三个处理组。A 组为对照组，B 组为IBD 活苗免疫组，C 组为ND-IBD 二联灭活疫苗免疫组；A、B、C 组分别于雏鸡7 日龄时进行免疫，分别皮下注射0.3 mL 生理盐水、0.3 mL IBD 活疫苗、0.3 mL ND-IBD 二联灭活疫苗。试验期42 d，免疫后每7 d 采血并进行血清的分离，采用中和试验检测IBDV 抗体水平。

1.2.2 抗体检测 在7 日龄时对之前已经采血的30 只鸡检测免疫前抗体水平，用中和试验的方法检测IBDV 抗体。各组于21、28、35、42 日龄也采血检测IBDV 抗体水平。IBDV 微量中和试验抗体水平检测方法，具体如下：（1）细胞维持液连续倍比稀释血清（1∶2～1∶64），分别取50 μL 加入96 孔板中，每个稀释度作4 孔。同时设置阴性血清和阳性血清对照。（2）加入50 μL 做200 TCID50病毒稀释病毒，置37 ℃温箱作用1 h。（3）每孔加入100 μL DF1 细胞悬液，置5% CO237 ℃温箱培养，自培养48 h 开始逐日观察记录。（4）结果判定和计算：当被检血清孔出现100% CPE 为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性，计算血清的中和抗体效价。其中培养板采用96 孔微量细胞培养板，血清的稀释采用固定抗原稀释血清的β 微量法，抗原用200 个TCID50。另外在做中和试验时应注意200 个TCID50的准确配制、控制每孔加入细胞的量和抗体作用的时间。

1.2.3 攻毒保护试验 在各组鸡21、28、35、42 日龄时，对其进行IBDV 攻毒保护试验，并在攻毒前对毒株进行毒力试验。每只口服0.2 mL IBDV BC6-85 株（2×104BID50），观察攻毒保护结果。操作步骤如下：

（1）将病毒原液分装于5 个试管中进行倍比稀释：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5；（2）选用同一批条件一致的SPF 鸡20 只，分成5 组，每组4 只，并在头部做标记。采用1 mL 注射器，每只鸡注射0.2 mL；（3）感染SPF 鸡72 h 后，剖检法氏囊观察病变情况并拍摄记录，统计感染鸡发病、死亡情况及半数致死量，并对攻毒保护率进行计算[8]。

1.2.4 引物设计与合成 在NCBI 上查找鸡CD4+、CD8+、IL-6 和GAPDH 基因核苷酸序列，采用Oligo7生物软件设计4 对特异引物，然后由上海生工生物工程股份有限公司合成。5′到3′方向引物序列及大小参考文献[9]。

1.2.5 组织RNA 提取及实时荧光定量PCR 总RNA 提取：剖检取脾脏与法氏囊组织，分别加液氮研磨破碎后放入裂解消化液中，冰上静置后离心，取水相过柱，去除杂质，最后用ddH2O 收集RNA。

反转录和实时荧光定量PCR 试验步骤参考文献[9]。CD4+、CD8+、IL-6 的mRNA 相对表达量计算方法采用的是2－ΔΔCT法[10]。

1.3 数据统计分析

统计分析软件为SPSS 17.0；序列比对分析软件为DNAMAN；荧光定量PCR 引物设计软件为Primer Express 3.0；实时荧光定量分析软件为Light Cyclcr 480。

2 结果与分析

2.1 ND-IBD 二联灭活疫苗与IBD 弱毒活苗对商品蛋鸡IBDV 抗体的影响

由图1 可知，在7～42 日龄，C 组IBDV 抗体水平均显著高于B 组（P＜0.05），且在21～42 日龄，C 组IBD 抗体水平逐渐上升，显著高于A 组与B 组（P＜0.05）；而随着日龄的增加，A 组与B 组抗体水平均逐渐下降，说明 ND-IBD 二联灭活疫苗能够更好、更快提升幼龄仔鸡的抗体水平。

2.2 攻毒保护试验结果

从表1 可知，21 日龄时和28 日龄时，C 组攻毒保护率均高于B 组与对照组；35 日龄及之后，A 组的攻毒保护率只有0，而C 组和B 组都是100%。可见，C 组和B 组均能有效保护商品蛋雏鸡免受IBDV 的感染。剖检结果从图2 可知，21 日龄和28 日龄时，A 组脾脏肿大，法氏囊肿大、出血，B 组法氏囊出血，C 组未见异常；而 35 日龄时，A 组脾脏肿大，法氏囊出血，其他组均正常。

图1 两种IBDV 疫苗对蛋鸡抗体形成水平的影响Fig.1 IBDV antibody in chicks after immunized by two different vaccines

表1 不同疫苗免疫蛋鸡的攻毒保护率Table 1 Survival rate of chicks after IBDV infection challenge test

图2 IBDV 攻毒试验保护脾脏和法氏囊病变情况Fig.2 Lesion occurrences on spleen and bursal of chicks after IBDV infection challenge test

2.3 鸡CD4+、CD8+、IL-6 和GAPDH 基因熔解曲线的建立及分析

从图3 可知，A 图中CD4+基因熔解温度控制在82～84 ℃时，B 图中CD8+基因熔解温度控制在83～85 ℃时，C 图中IL-6 基因熔解温度控制在83～85 ℃时，D 图GAPDH 基因熔解温度控制在83～85 ℃时，无引物二聚体及非特异性产物等杂峰出现[10]。表明CD4+、CD8+、IL-6 和GAPDH 基因的引物均具有良好的特异性。

2.4 ND-IBD 二联灭活疫苗与弱毒活苗对商品蛋鸡法氏囊中CD4+、CD8+、IL-6 的mRNA 表达量的影响

从图4 可知，法氏囊中C 组基因CD4+、CD8+、IL-6 的mRNA 表达量总体趋势随着鸡日龄的增长而升高，且表达量均高于B 组与A 组，所测日龄中，CD4+的表达量均是C 组与B 组显著高于A 组，在21 日龄时C 组与B 组差异不显著（P＞0.05），其他日龄C 组显著高于B 组（P＜0.05）（图4-A）；在21、28 日龄时，B 组CD8+基因的mRNA 表达量显著高于A 组（P＜0.05），但与C 组差异不显著，而在35、42 日龄时，C 组基因CD8+的mRNA 表达量显著高于B 组（P＜0.05）（图4-B）；在28、35、42 日龄时，C 组基因IL-6 的mRNA 表达量显著高于B 组（图4-C）。可见，ND-IBD 二联灭活疫苗和弱毒活苗均可以诱导法氏囊中CD4+、CD8+、IL-6 基因的表达，但是ND-IBD 二联灭活疫苗比弱毒活苗具有诱导CD4+、CD8+、IL-6 基因更长时间表达的特点。

2.5 ND-IBD 二联灭活疫苗与弱毒活苗对商品蛋鸡脾脏中CD4+、CD8+、IL-6 的mRNA 表达量的影响

从图5 可知，脾脏中所检测的CD4+、CD8+、IL-6 基因的mRNA 表达量是：C 组随着鸡日龄的增长而升高，除21 日龄外，均显著高于B 组与A 组（P＜0.05）。42 日龄时，B 组CD4+表达量与A 组差异不显著（P＞0.05），其他日龄差异显著（P＜0.05） （图5-A）。所有日龄中，C 组与B 组基因CD8+的mRNA 表达量比A 组显著增加（P＜0.05）（图5-B）；所有日龄中，C 组与B 组基因IL-6 的mRNA 表达量比A 组显著增加（P＜0.05）（图5-C）。可见，ND-IBD 二联灭活疫苗和弱毒活苗均可以诱导脾脏中CD4+、CD8+、IL-6 基因的表达，但是ND-IBD 二联灭活疫苗比弱毒活苗具有诱导CD4+、CD8+、IL-6 基因更长时间表达的特点。

图3 CD4+、CD8+、IL-6 和GAPDH 基因的熔解曲线Fig.3 Melting curves of CD4+, CD8+, IL-6, and GAPDH

图4 各日龄鸡的法氏囊组织中基因CD4+、CD8+、IL-6 表达量变化水平Fig.4 mRNA expressions of CD4+, CD8+, and IL-6 in infectious bursal tissue

3 讨论

据研究报道，接种鸡法氏囊炎弱毒活疫苗由于受母源抗体的干扰，致使免疫效果千差万别，有时甚至导致免疫失败。中等毒力活疫苗虽能达到更好的免疫效果，但又会引起法氏囊组织损伤、毒力返强、残留毒力导致的免疫抑制，以及参与新变异株基因重组等一系列生物安全问题[11-12]。活苗免疫后在产生抗体时，也会引起机体免疫器官损伤[13]，如Rautenschlein 等[14]证实了带有中等强度毒株的弱毒疫苗虽然可以克服母源性抗体的干扰对机体产生抗体，但是由于毒力足够突破母源抗体而感染雏鸡造成法氏囊损伤，严重时会导致雏鸡出现免疫抑制。可见弱毒活苗易受母源抗体的影响，在免疫早期效果不理想。

图5 各日龄鸡的脾脏组织中基因CD4+、CD8+、IL-6 表达量变化水平Fig.5 The mRNA expression of CD4+、CD8+、IL-6 in spleen

预防ND 与IBD 需对雏鸡多次免疫，易引起雏鸡应激反应，造成经济损失。为了减少免疫次数过多而导致鸡群的应激反应，近年来国内开始对联苗的研究投入大量的人力、物力[15]。研发的灭活疫苗具备安全性并保留良好的抗原性且无副作用。针对鸡传染性法氏囊病活苗免疫效果不理想的问题，本试验选择了具有高度浓缩抗原的ND-IBD 二联灭活苗与市场常规IBD 活疫苗进行比较分析二者免疫效果，结果发现具有高度浓缩抗原的ND-IBD 二联灭活苗表现出了抗体形成早、维持时间长的优势。

另外，本试验还发现7 日龄雏鸡进行ND-IBD 二联灭活苗免疫，攻毒保护效果理想。吴玲等[16]研究也表明IBD 活苗免疫越早受母源抗体干扰越大。有研究[17]表明，7 日龄处于母源抗体半衰期后，母源抗体对疫苗抗原影响小，免疫效果优于1 日龄。一般预防接种IBD 与ND 疫苗均选用7 日龄免疫。

本研究发现，具有高度浓缩抗原的ND-IBD 二联灭活苗能够更好地保护免疫器官。章振华等[18]分别用鸡传染性法氏囊病免疫复合物疫苗和活疫苗免疫1 日龄SPF 雏鸡，免疫后9 d 剖检发现，免疫器官法氏囊萎缩情况存在明显差异，免疫复合物疫苗组正常，而活疫苗组全部萎缩，免疫后21 d 和28 d，复合物疫苗免疫组的保护率均达到了100%。

淋巴细胞表面分子和细胞介素对于机体的免疫功能具有重要的调节功能。本试验采用的二联灭活苗也有效提高了脾脏和法氏囊的CD4+、CD8+和IL-6 基因的转录水平量。有研究[19]指出，使用鸡白细胞介素-2 或鸡白细胞介素-18 融合表达的IBDV VP2蛋白进行免疫，其免疫原性会增强。研究发现[20]，CD4～+CD25～+调节性T 细胞具有免疫抑制作用。CD4～+CD25～+调节性T 细胞可由多种类型肿瘤、病原体诱导产生。一方面抑制炎症，另一方面有利于肿瘤和病原体逃避宿主免疫攻击。郑笑笑[21]分析了白细胞介素（IL-2、IL-6）、T 细胞亚群（CD4+/CD8+、CD4+、CD8+）水平与慢性丙型肝炎患者病情程度的关联性，结果发现：血清IL-2、CD4+/CD8+、CD4+与慢性丙型肝炎病情呈负相关；血清IL-6、CD8+与慢性丙型肝炎病情呈正相关。钱文亚等[22]探讨和分析CD4+T、CD8+T 细胞及白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-6（IL-6）、干扰素（IFN-γ）等水平的检测在支原体肺炎中的临床价值，并研究说明了人体感染肺炎后体内CD4+T、CD4+/CD8+细胞比值失衡，支原体肺炎经有效治疗后，外周血中CD4+T、CD8+T明显增加，而IL-4、IL-6、IFN-γ 水平明显下降。