HPLC 检测植物油中黄曲霉毒素B1 含量的不确定度评价

韩晓萌，杨臻慧，陆敏芳，俞昕成，王李佳

（嘉兴中科检测技术服务有限公司 浙江中科院应用技术研究院分析测试中心，浙江 嘉兴 314000）

黄曲霉毒素（aflatox-ins,AF）、赭曲霉毒素（ochratoxins,OT）等曲霉类毒素证明具有致癌、致畸和致突变性，根据中国农科院农产品加工研究所统计，2001 至2011 年10 年间，受真菌毒素污染的影响，我国出口欧盟食品违例事件达2 559 起，其中真菌毒素超标占28.6%。曲霉类真菌毒素污染谷物和油料等作物已成为全球性问题。

黄曲霉毒素检测主要有酶联免疫法、薄层色谱法、荧光光度法、高效液相色谱法（IAC 技术（免疫亲和柱净化法）、SPE 技术（固相萃取净化法））、液相色谱-质谱法（IAC 技术，SPE 技术），检测方法品种多，适用范围不同，使得黄曲霉毒素检测选择繁琐，效率低下，同时一些检测方法的重复性差，引入的不确定度分量多，导致结果在置信区间的范围宽。针对现有技术缺点，本文做了采用ICA 技术的高效液相色谱法对植物油中的黄曲霉毒素B1 进行测定，并进行不确定度评价，分析各不确定度分量对测定结果的影响，从而在试验过程中控制各分量的输入，使测试结果更加可靠。

1 实验

1.1 试剂和仪器

高效液相色谱仪：具荧光检测器，柱后光化学衍生装置（PD3110）（大连依利特分析仪器有限公司）；电子天平，离心机，氮吹仪，固相萃取装置，超声波清洗机，移液枪，黄曲霉毒素免疫亲和柱。

甲醇，实验室一级用水，黄曲霉毒素B1 标准品（TMstandard®）。

1.2 提取

称取5 g 试样于50 mL 离心管中，加入20 mL 甲醇-水溶液（70＋30），涡旋混匀，置于超声波清洗机30 min，在5 000 r/min 下离心10 min，取上清液备用。

1.3 净化

免疫亲和柱恢复室温，准确移取4 mL 上述上清液，加入23 mL 1% TritonX-100，混匀。免疫亲和柱内的液体放弃后，在免疫亲和柱中样液以 1～3 mL/min 的速度稳定下滴。待样液滴完后，以稳定流速用20 mL 水淋洗免疫亲和柱。待水滴完后，用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统，在亲和柱下部放置10 mL刻度试管，2×1 mL 甲醇洗脱亲和柱，控制1～3 mL/min 的速度下滴。用真空泵抽干亲和柱，收集全部洗脱液至试管中。在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，用1 mL 移液枪加入1.000 mL 初始流动相。过膜上机。

1.4 色谱条件

色谱柱：SinoChrom ODS-BP 5 µm 4.6 mm×250 mm。柱温为35℃。进样量为10 μL。流动相为甲醇/乙腈/水（30∶30∶40）激发波长为360 nm；发射波长为440 nm。

2 结果与讨论

2.1 不确定度来源

不确定度来源如图1 所示。

图1 不确定度来源

2.2 样品称量引起的不确定度

电子天平称量范围0.01 g～50 g，最大允许误差为0.000 5 g，属B 类评定，标准不确定度如式（1）所示。

称量引入相对不确定度，如式（2）所示。

2.3 重复性不确定度

对样品进行10 次平行测定，样品中黄曲霉毒素B1 测试结果如表1 所示，重复性试验用B 类评定。

表1 样品中黄曲霉毒素B1 的平行测试结果

由表1 得，10 次重复性测试均值如式（3）所示。

实验标准偏差如式（4）所示。

被测量估计值标准不确定度如式（5）所示。

2.4 标准品的不确定度

黄曲霉毒素B1 标准品浓度为2.00 μg/mL，标准物质证书给出不确定度为3.0%，属B 类评定，所以黄曲霉毒素B1 相对标准不确定度为

2.5 标准曲线拟合引入的不确定度

对每个浓度点重复测量三次，共18 次，测得的浓度与峰面积对应值如表2 所示。

表2 黄曲霉毒素B1 标准系列浓度对应峰面积

以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标拟合曲线方程y＝366.951 18 x，相关系数r＝0.999 491 2。由表1可知c0＝1.795 5 ng/mL，由表2 可知标准溶液试样黄曲霉毒素B1 含量通过式（6）计算标准曲线的残差标准偏差。

将线性拟合标准不确定度如式（7）所示。

2.6 实验过程中量器引起的不确定度

量器引入的按B 类评定，各量器引入的不确定度如表3 所示。

表3 量器引起的不确定度

实验中量器引入的的相对不确定度如式（8）所示。

2.7 回收率引起的不确定度

对阴性样品进行加标实验，回收率如表4 所示。

表4 黄曲霉毒素B1 的加标回收率

用A 类评定，回收率标准不确定度为式（9）所示。

2.8 合成标准不确定度和扩展不确定度

表5 测量不确定度分量

结合表5 各不确定度分量可得合成不确定度如式（10）、（11）所示。

3 结论

本实验中植物油中黄曲霉毒素B1 含量的不确定度的最终评定结果果为：黄曲霉毒素B1 含量为1.795 5 μg/kg 的样品中，扩展不确定度为0.212 μg/kg。实验所引入的不确定度分量中线性拟合所引入的不确定度对最终结果影响最大贡献占71.0%，其次标准物质本身和溶液稀释及配制中量器引入的不确定度分量贡献28.1%，称量和重复性、回收率试验所引入的不确定度非常小，可忽略不计。