黑老虎叶总黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究

李亚军 黄国保 全海燕 易鹊 谭明雄

摘 要：為探讨超声波辅助提取黑老虎叶总黄酮的最佳提取工艺条件及其抗氧化活性，该文以黑老虎叶为研究对象，采用超声波提取法提取黑老虎叶总黄酮，通过单因素试验研究提取时间、乙醇浓度、提取温度、料液比对黑老虎叶总黄酮提取率的影响，在单因素试验的基础上，采用正交试验优化其提取工艺条件，测试了最优条件下提取的黑老虎叶总黄酮对DPPH自由基、·OH自由基及超氧阴离子的清除能力。结果表明：黑老虎叶总黄酮超声辅助提取最佳提取条件为提取时间 35 min、乙醇浓度80%、提取温度50 ℃、料液比1∶20 g·mL-1，最佳条件下提取率为4.83%。抗氧化活性测试结果显示，黑老虎叶总黄酮表现出较好的清除DPPH自由基、·OH自由基及超氧阴离子能力，其抗氧化能力为清除DPPH自由基能力>清除超氧阴离子能力>清除·OH自由基能力。在浓度为0.8 mg·mL-1时，黑老虎叶总黄酮清除DPPH自由基、·OH自由基及超氧阴离子的能力相当于同浓度下Vc的97.6%、82.1%、

95.5%，黑老虎叶总黄酮是天然抗氧化剂的良好来源。上述结果为黑老虎叶活性成分的提取及开发利用提供了理论基础。

关键词：黑老虎叶，总黄酮，超声波辅助提取，工艺优化，抗氧化活性

中图分类号：Q946

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2020）09-1381-08

Abstract：In order to study the optimum extraction conditions and antioxidant activity of total flavonoids from Kadsura coccinea leaves assisted by ultrasound extraction method，the ultrasonic-assisted extraction method of total flavonoids from K. coccinea leaves was studied，the influence factors of extraction time，ethanol concentration，extraction temperature and solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids from K. coccinea leaves were studied by single factor expe-riment， and orthogonal experiment was used to optimize the extraction process. The scavenging effects of total flavonoids extracted from K. coccinea leaves on DPPH，·OH and superoxide anion were tested under the optimum conditions. The results showed that the optimal extraction conditions were as follows：extraction time 35 min，ethanol concentration 80%，extraction temperature 50 ℃ and solid-liquid ratio 1∶20 g·mL-1 ，the maximum yield was 4.83%. The antioxidant activity test showed that total flavonoids of K. coccinea leaves had strong scavenging abilities on DPPH free radicals，·OH free radicals and superoxide anions. The order of antioxidant activities of total flavonoids from K. coccinea leaves was as follows：DPPH free radicals scavenging ability > superoxide anions scavenging ability > ·OH scavenging ability. At the concentration of 0.8 mg·mL-1，the scavenging abilities of total flavonoids from K. coccinea leaves on DPPH， ·OH free radicals and superoxide anions were equivalent to 97.6%，82.1% and 95.5% of Vc at the same concentration，respectively. Total flavonoids of K. coccinea leaves were good sources of natural antioxidants. This study provides theoretical information for the extraction and utilization of active ingredients from K. coccinea leaves.

Key words：Kadsura coccinea leaves，total flavonoids，ultrasonic-assisted extraction，technology optimization，antioxidant activity

黑老虎（Kadsura coccinea）为五味子科南五味子属常绿木质藤本植物，别名过山龙、冷饭团、钻地风等，主要分布于我国江西、湖南、福建、广西等地（延在昊等，2013）。黑老虎是一种药食两用的中药材，根茎叶果实均可药用，其根莖为主要药用部位，具有行气活血，通经止痛等作用（陆俊等，2018）。现代药理活性研究表明黑老虎根茎及果实中的多种活性成分具有保肝（Song et al.，2010）、抗炎抑菌（Li et al.，2012）、抗肿瘤（Zhao et al.，2014）、抗HIV（杨毅等，2003）、抗氧化（延在昊等，2013;谢玮等，2016）、抗凝血（Su et al.，2019）、调节血脂（李志春等，2011）等作用。黑老虎叶四季常青，其叶可用于治疗湿疹（Rehman et al.，2019）。目前，关于黑老虎有效成分的提取及药理活性研究主要集中在其根茎及果实，对其叶的开发利用报道较少。

抗氧化剂包括两大类：化学合成抗氧化剂与天然抗氧化剂。由于天然抗氧化剂具有安全、无毒的特点，从植物中寻找天然抗氧化剂已成为国内外研究的热点。黄酮类化合物广泛存在于植物的叶与果实中，有研究报道从植物中提取的黄酮类化合物具有较强的抗氧化作用（Chanput et al.，2016），如罗布麻叶总黄酮（潘思源等，2019）、藿香叶黄酮（艾薇等，2018）、红姑娘茎叶总黄酮（姜秀娟等，2018）等多种植物叶总黄酮具有显著的抗氧化活性，可用于天然抗氧化剂的开发。目前，关于黑老虎抗氧化活性的报道主要有黑老虎茎中的挥发油成分（Rehman et al.，2019）、黑老虎果中花色苷（郝杰，2014）及β-环糊精和它的衍生物2-羟丙基-β-环糊精包合黑老虎果实花色苷提取物（Su et al.，2018）、黑老虎根中的酚酸类成分（延在昊等，2013）。黑老虎叶中黄酮成分作为天然抗氧化剂的研究未见报道。因此，从药用植物黑老虎叶中高效提取总黄酮并研究其抗氧化性非常重要。黄酮类化合物的提取有临界流体萃取（SFE）、溶剂提取法、超声辅助提取（UAE）、微波辅助提取（MAE）、脉冲电场（PEF）辅助提取、酶辅助提取（EAE）等，其中超声辅助提取具有提取效率高、提取时间短、溶剂用量少、提取方法简便等优点而被广泛使用（万新焕等，2019）。

本研究采用超声辅助提取黑老虎叶总黄酮，并从提取时间、乙醇浓度、提取温度、料液比四个因素优化黑老虎叶总黄酮提取工艺，进一步测定了最优提取条件下黑老虎叶总黄酮的抗氧化活性，为黑老虎叶总黄酮的提取提供技术指导，为其开发为天然抗氧化剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器、设备

1.1.1材料 黑老虎叶：5月份采摘于湖南环境生物职业技术学院林下种植基地内，经湖南环境生物职业技术学院医药技术学院杨军衡副教授鉴定为五味子科（Schisandraceae）南五味子属 （Kadsura Jussieu）植物黑老虎（Kadsura coccinea）。

1.1.2 试剂 芦丁标准品（纯度≥98 %）：北京普析科技有限公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、维生素C、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）、盐酸、双氧水、水杨酸、95%乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、邻苯三酚、石油醚、氢氧化钠等试剂都为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器和设备 UV-2600紫外可见分光光度计（上海百贺仪器科技有限公司）;KQ-5200E超声波清洗仪（长沙天恒仪器有限公司）;XB-0.3 真空旋转浓缩仪（上沈阳乐华生物制药设备有限公司）;FA 124万分之一电子分析天平（湖南轩彩科学仪器有限公司）;DHG-9000- 9030A电热恒温鼓风干燥箱（长沙天恒仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 黑老虎叶中总黄酮的提取 黑老虎叶采摘后洗净，60 ℃下烘干至恒重，粉碎后过60目筛即得黑老虎叶粉末。精确称取黑老虎叶粉末2.0 g，石油醚脱脂，滤渣在超声功率为250 W，在一定提取温度、提取时间、乙醇浓度和料液比条件下进行超声辅助提取，提取液减压浓缩，70%乙醇定容于100 mL容量瓶中，得黑老虎叶总黄酮样品溶液。

1.2.2 芦丁标准曲线的制备 采用 NaNO2 -Al（NO3）3-NaOH 法（梁志远等，2016）制备芦丁标准曲线。准确称取干燥好的芦丁50 mg，用70%乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中。准确量取芦丁样品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL容量瓶中，分别依次加入0.8 mL 5% NaNO2与10% Al（NO）3，每加入一次试剂室温下反应5 min，然后再加入10 mL 1 mol·L-1 NaOH后用70%乙醇定容至刻度，室温下反应15 min，在510 nm处测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，芦丁溶液浓度C（mg·mL-1）为横坐标制作标准曲线：y=4.541 1x+0.002 6，R2 =0.999 3。

1.2.3 总黄酮含量的测定和计算 准确量取1.2.1中黑老虎叶总黄酮样品溶液1 mL，按照1.2.2方法测定样品溶液吸光度，将测定所得吸光度代入标准曲线计算出测试溶液总黄酮浓度C（mg·mL -1）。按照下式计算总黄酮提取率（%）：提取率=C100%。式中：V为提取液体积（mL）;N为稀释倍数;m为黑老虎叶粉末重量（g）。

1.2.4 单因素试验和正交优化试验 按照1.2.1的方法，在其他因素一定的情况下，分别以不同提取时间（15、25、35、45、55 min）、乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%）、提取温度（40、50、60、70、80 ℃）和料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 、1∶30 g·mL -1）进行单因素试验。

根据单因素试验结果，选择提取时间（A）、乙醇浓度（B）、提取温度（C）、料液比（D）为自变量，以黑老虎叶总黄酮提取率为评价指标，采用L9（34）正交试验优化黑老虎叶总黄酮提取工艺参数，正交试验因素水平如表1所示。

1.2.5 黑老虎叶总黄酮抗氧化试验 在最优条件下提取得到的黑老虎叶总黄酮按照以下方法进行抗氧化活性试验测试。

1.2.5.1 黑老虎叶总黄酮对DPPH清除能力的测试 参照庞玉新等（2015）的方法，将最优条件下提取的黑老虎叶总黄酮溶解于70%乙醇配制成不同浓度（0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL -1）的样品溶液，分别取以上样品溶液1.0 mL，加入2.5 mL一定浓度的DPPH溶液，反应半小时后测定其吸光度，相同条件下测定空白对照溶液吸光度，以Vc为对照品。

1.2.5.2 黑老虎叶总黄酮对·OH自由基清除能力的测试 参照姜秀娟等（2018）的水杨酸法，测试最优条件下提取的黑老虎叶总黄酮（溶于70%乙醇）在不同浓度下（0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL -1）对·OH自由基的清除能力，以Vc為对照品。

1.2.5.3 黑老虎叶总黄酮对超氧阴离子清除能力的测试 将最优条件下提取的黑老虎叶总黄酮溶解于70%的乙醇配制成不同浓度（0.025、0.05、0.075、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL -1）样品溶液，参照范艳丽等（2017）的邻苯三酚氧化法，测定以上样品溶液对超氧阴离子的清除能力，相同条件下测定空白对照溶液吸光度，以Vc为对照品。

1.3 数据处理分析

所有实验都重复进行3次，所得数据都以平均值±标准误差表示，采用 Microsoft Excel 2010、SPSS 20.0、 Design Expert8.0.6 软件进行数据处理、分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间对黑老虎叶总黄酮提取率的影响 如图1所示，在15～35 min，黑老虎叶总黄酮提取率随着时间的延长而逐渐增加，35 min时达到最大值4.31%;随着时间的延长，提取率有所下降。这可能是因为时间较短时，黑老虎叶总黄酮并没有提取完全，所以时间增长提取率增大;然而加热提取时间较长则可能会破坏黄酮的结构而导致黑老虎叶中总黄酮提取率下降（李欣燃等，2019）。因此，提取时间优化试验范围为25～45 min。

2.1.2 乙醇浓度对黑老虎叶总黄酮提取率的影响 如图2所示，在乙醇浓度为40%～70%，黑老虎叶总黄酮提取率呈线性递增，70% 时达到最大值4.62%，随后提取率下降。根据“相似相溶”原理，黑老虎叶总黄酮的极性与70%乙醇极性相似，所以在乙醇浓度为70%时提取率最大;随着乙醇浓度的增大，醇溶性杂质提取程度也会增大，由于杂质与黄酮存在竞争关系，从而导致黄酮提取率的降低（艾薇等，2018）。因此，乙醇浓度优化实验范围为60%～80%。

2.1.3 提取温度对黑老虎叶总黄酮提取率的影响 如图3所示，温度低于60 ℃时，黑老虎叶总黄酮提取率随着温度的增加逐渐增大，60 ℃达到最大值4.53%，随后提取率逐渐降低。这可能是由于温度的升高分子间运动变得剧烈，增大了黄酮与乙醇的接触机会，所以提取率增大;但温度过高也会造成部分黄酮结构破坏，从而降低提取率（张军武和赵琦，2012）。因此，提取温度优化实验范围为50～70 ℃。

2.1.4 料液比对黑老虎叶总黄酮提取率的影响 如图4所示，在物料一定时，总黄酮提取率随着溶剂量的增加逐渐增大，1∶20 g·mL-1时达到最大值4.53%，而当料液比大于1∶20 g·mL-1后总黄酮提取率增大不明显。这可能是由于在一定范围内，溶剂量的增加导致物料与溶剂的接触面积增大，故黄酮提取率增大;而当料液比达到一定值后，物料与溶剂量的比例达到一个饱和状态，此时再增加溶剂的量对提取率影响不大，反而会造成溶剂的浪费。因此，乙醇浓度优化实验范围为1∶15 ～ 1∶25（g·mL-1）。

2.2 正交优化试验

由表2可知，各因素影响黑老虎叶总黄酮提取率的顺序如下：乙醇浓度（B）> 提取时间（A）> 提取温度（C）>料液比（D）。最佳提取条件为A2B3C1D2，即提取时间为35 min、乙醇浓度80%、提取温度50 ℃、料液比1∶20 g·mL-1。在此条件下黑老虎叶总黄酮提取率为4.83%。

2.3 黑老虎叶总黄酮抗氧化试验

2.3.1黑老虎叶总黄酮清除DPPH自由基能力 由图5可知，在浓度为0～0.20 mg·mL-1时，随着黑老虎叶总黄酮浓度的增加，其对DPPH自由基清除能力逐渐增大。在浓度为0.8 mg·mL-1时，黑老虎叶总黄酮对DPPH自由基清除率为94.3%，相当于该浓度下Vc对DPPH自由基清除率的97.6%，表明黑老虎叶总黄酮能够很好地清除DPPH自由基。

黑老虎叶总黄酮清除DPPH自由基的IC50为0.067 mg·mL-1，段宙位等（2015）研究了沉香叶黄酮类化合物清除DPPH自由基的IC50为1.14 mg·mL-1，表明黑老虎叶总黄酮对DPPH自由基具有较好的清除能力。

2.3.2 黑老虎叶总黄酮清除·OH自由基能力 由图6可知，在浓度为0～0.20 mg·mL-1时，黑老虎叶总黄酮对·OH自由基清除能力随着浓度的增加逐渐增大。在浓度为0.8 mg·mL-1时，虽然黑老虎叶总黄酮对·OH自由基的清除能力低于同浓度下的Vc，但其对·OH自由基清除率达到了82.1%，相当于该浓度下Vc清除·OH自由基能力的87.2%，表明黑老虎叶总黄酮对·OH自由基有较好的清除能力。

黑老虎叶总黄酮清除·OH自由基的IC50为0.125 mg·mL-1。艾薇等（2018）研究了藿香叶总黄酮清除·OH自由基的IC50为281.89 mg·mL-1，表明黑老虎叶总黄酮能较好地清除·OH自由基。

2.3.3 黑老虎叶总黄酮清除超氧阴离子能力 由图7可知，黑老虎叶总黄酮对超氧阴离子清除能力随着浓度的增加逐渐增大，这说明二者之间存在明显的量效关系。在浓度为0.8 mg·mL-1时，黑老虎叶总黄酮对超氧阴离子清除率为93.7%，相当于该浓度下Vc清除超氧阴离子能力的95.5%，表明黑老虎叶总黄酮能够较好地清除超氧阴离子。

黑老虎叶总黄酮清除超氧阴离子的IC50为0.091 mg·mL-1，张黎明等（2014）研究了玛咖叶总黄酮清除超氧阴离子的IC50为0.425 mg·mL-1，表明黑老虎叶总黄酮对超氧阴离子具有较好的清除能力。

3 讨论与结论

黄酮存在于植物的叶、花及果实中，目前关于黄酮的提取方法有超声辅助提取法、溶剂提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法等（万新焕等，2019）。超声辅助提取法通过提供高频率振动，结合空化、机械等多种效应使植物细胞壁破裂;溶剂通过扩散、渗透等效应，根据“相似相溶”原理将细胞内有效成分溶解出来。相比传统的溶剂提取法，高频率的超声波产生的能量可以缩短提取时间，减少溶剂用量，降低提取温度，提高提取效率。相比超临界流体萃取法而言，其对提取设备要求较简单。超声提取法由于其绿色环保、提取效率高、提取条件温和受到了广大研究者的喜爱（Garcia-Castello et al.，2015）。本研究以湖南珍稀资源黑老虎叶为研究对象，采用超声辅助提取其总黄酮，通过单因素及正交实验得到最佳提取工艺条件为时间35 min、乙醇浓度80%、提取温度50 ℃、料液比1∶20 g·mL-1，最优条件下提取率为4.83%，提取效率较高。

科学研究发现，当人体新陈代谢过程中产生的自由基得不到及时清除，过多的自由基将通过氧化作用对人体造成各种损害，如衰老、心血管疾病及炎症等（周益帆等，2019）。从天然植物中寻找副作用低、效果好的抗氧化剂是现在的研究热点。黄酮由于其独特的结构特点，常作为天然抗氧化剂来源。黄酮发挥其抗氧化作用机制主要通过三个方面：（1）作用于产生自由基的酶或过渡金属离子来间接清除自由基;（2）直接清除自由基（如DPPH自由基、·OH自由基及超氧阴离子等）;（3）通过激活机体抗氧化体系（如酶体系、抗氧化因子等）来实现清除自由基（鲁晓翔，2012）。本研究通过测试黑老虎叶总黄酮清除DPPH自由基、·OH自由基及超氧阴离子的能力来评估其抗氧化强弱。在浓度为0.8 mg·mL -1时，黑老虎叶总黄酮清除DPPH自由基、·OH自由基及超氧阴离子的能力相当于同浓度下Vc的97.6%、82.1%、95.5%，这表明黑老虎叶总黄酮具有较好的清除以上三种自由基的能力，可以作为天然抗氧化剂来源。这可能是由于黑老虎叶黄酮苯环上存在的羟基能够和自由基发生氧化还原反应生成稳定的半醌式结构，从而阻碍了自由基链式反应的发生而发挥抗氧化作用（鲁晓翔，2012）。

黑老虎为广西、湖南等地常见的药食两用的珍贵植物，目前对黑老虎有效成分的研究主要集中在根茎及果实，对其叶的开发利用鲜有报道。本研究立足于湖南珍稀植物黑老虎叶，探讨了高效提取其总黄酮的工艺条件，为其提取提供技术路线;测试了黑老虎叶总黄酮体外抗氧化活性，为其用于食品保健品及护肤品的开发提供理论基础。此外，在后续研究中可进一步探讨黑老虎叶总黄酮体内抗氧化活性、作为抗氧化剂用于保健品或药物的剂型及其他生物学活性，如抗炎、抗肿瘤等。

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（责任编辑 周翠鸣）