野菊花总黄酮的提取工艺研究

白现广 王惠平 刘永莹 郝丽亚 齐闪闪 范卫卫

摘要：目的：优化野菊花总黄酮的提取工艺，为野菊花总黄酮的开发和利用提供基础。方法：通过正交试验的方法，以野菊花的总黄酮含量作为指标，从溶剂浓度、料液比、提取温度、提取时间4个因素，筛选野菊花总黄酮的最佳提取工艺。结果：乙醇法提取野菊花总黄酮的最佳工艺条件为乙醇浓度80%、料液比1：25、温度80℃、提取时间2h，提取率为4.90%。结论：通过正交试验对野菊花总黄酮的提取工艺进行优化，可提高野菊花总黄酮的提取率。

关键词：野菊花;总黄酮;提取

中图分类号：R284.2 文献标志码：A

野菊花是菊科植物野菊（Chrysanthemum indiellm）的干燥头状花序，性微寒，具有散风热、平肝明目之功效，是临床常用中草药。研究表明，野菊花中含有黄酮类、三萜类和挥发油等化学成分。其中，总黄酮是野菊花发挥药理作用的最重要的活性成分之一，具有保护心脑血管系统、抗氧化、保肝、抗炎、抗肿瘤等药理作用。目前野菊花总黄酮提取工艺主要包括：有机溶剂提取法、微波提取法、酶辅助提取法及超声波提取法等。本实验使用乙醇为有机溶剂提取野菊花中的总黄酮，通过单因素考察和正交试验优化确定野菊花总黄酮乙醇提取法的最佳工艺条件，为野菊花总黄酮的进一步研究、开发和利用奠定基础。

1实验材料与仪器

1.1实验材料与试剂

实验材料：野菊花于2018年10月采自平顶山市新华区落凫山南坡，经平顶山学院医学院范卫卫博士鉴定为菊科植物野菊（Chrysanthemum indicum）。

实验试剂：芦丁标准品（纯度≥98%）购自合肥博美生物科技有限责任公司;亚硝酸钠（分析纯）购自洛阳吴华化学试剂有限公司;硝酸铝（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司;氢氧化钠（分析纯）购自天津市大茂化学试剂厂;乙醇（分析纯）购自天津市德恩化学试剂有限公司。

1.2仪器设备

FAl004N型电子天平（上海菁海仪器有限公司）;DZKw-4型电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）;DHG-9202-1S型电热恒温干燥箱（上海鸿都电子科技有限公司）;SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵（河南省予华仪器有限公司）;T6型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）;XT-350型高速多功能粉碎机（浙江永康市红太阳机电有限公司）;1830c型纯水机（重庆摩尔水处理设备有限公司）。

2实验方法

2.1原材料处理

新鲜野菊花放入65℃干燥箱烘干至恒重，高速粉碎机粉碎，过60目筛，密封，干燥通风处储存备用。

2.2总黄酮的提取方法

野菊花干燥粉末，乙醇浸提，抽濾，得到含总黄酮浸提物。设计不同乙醇浓度、不同料液比、不同提取温度、不同提取时间进行单因素考察及正交试验，以野菊花总黄酮得率为指标，确定野菊花中总黄酮的最佳提取条件。

2.3总黄酮含量的测定

采用硝酸铝比色法，以芦丁（标准样）做标准，使用紫外分光光度计在510 nm波长处比色，测定野菊花中总黄酮的含量。

2.4芦丁标准溶液配置及标准曲线绘制

分析天平精密量取20 mg芦丁标准品于100 mL容量瓶，用60%乙醇进行定容，得到0.2 mg/mL的标准溶液。移液管分别移取0 mL，1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL，4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL芦丁标准溶液于25 mL容量瓶。每个容量瓶先分别移取5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀并静置于实验台6min，再分别加入10%硝酸铝溶液1.0mL，摇匀并静置于实验台6 min，最后分别加入4%氢氧化钠溶液10.0mL，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀并静置于实验台15 min，使用紫外分光光度计在510 nm波长处测定各瓶溶液的吸光度，以吸光度A作为纵坐标，芦丁标准溶液的浓度c作为横坐标，绘制标准曲线如图1所示，并计算回归方程。处理实验数据后，得到标准曲线的回归方程如下：

2.5总黄酮提取率的计算

黄酮提取率（%）=（待测液总黄酮的浓度x50x25）/（吸取的待测液体积XmxlOOO）x100%;

其中，50为滤液定容时所用的体积（mL）;25为测吸光度A时定容所用的体积（mL）;m为所取药物质量（g）。

2.6正交设计

影响野菊花总黄酮含量的因素主要有提取溶剂的浓度（A）、料液比（B）、提取温度（C）以及提取时间（D），用这些因素设计L9（3⁴）因素水平表，见表1所列。

3实验结果与分析

3.1提取工艺单因素实验的结果与分析

3.1.1提取溶剂浓度

在料液比1：15、提取时间1 h、提取温度50℃的条件下，研究提取醇浓度对总黄酮提取效果的影响，结果如图2所示。随着醇浓度的增大，曲线呈上升趋势，在70%醇浓度时达到最大值，说明此时黄酮提取率最大，随后曲线开始降低。因此，应选取70%的乙醇作为提取黄酮类化合物的最佳提取浓度。在提取溶剂浓度为70%的乙醇溶液时，野菊花总黄酮的含量为44.68 mg/g，提取率为4.47%。

3.1.2液料比

在醇浓度50%、提取时间1 h、提取温度50℃的条件下，研究料液比对总黄酮提取效果的影响，结果如图3所示。随着料液比的增加，曲线呈上升趋势，在料液比为1：20时达到最大值，说明此时黄酮提取率最大，随后曲线降低。因此，提取黄酮类化合物的最佳提取料液比应选取20：1。提取溶剂的料液比为20：1时，野菊花总黄酮的含量为45.44 mg/g，提取率为4.54%。

3.1.3提取温度

在醇浓度50%、料液比1：15、提取时间1 h的条件下，研究提取温度对总黄酮提取效果的影响，结果如图4所示。随着温度的升高，曲线呈上升趋势，80℃时达最高点，说明此时黄酮提取率最大，温度继续升高，曲线下降。因此，应选取80℃作为提取黄酮类化合物的最佳提取温度。提取温度为80℃时，野菊花总黄酮的含量为40.67 mg/g，提取率为4.07%。

3.1.4提取时间

由图5可以看出，在料液比1：15、醇浓度50%、温度50℃的条件下，研究提取时间对总黄酮提取效果的影响，随着时间的增长，曲线先呈上升趋势，在1.5 h时达到最高点，而后下降，说明此时黄酮提取率最大。因此提取的最佳时间为1.5 h，此时野菊花总黄酮的含量为41.54 mg/g，提取率为4.15%。

3.2正交实验结果与分析

正交实验结果见表2所列，根据表2中R值可知，A>D>c>B，故总黄酮提取率主要影响因素为提取溶剂的浓度，影响最小的是料液比。由表2可知实验的最佳提取工艺为A3、B3、C2、D，，即提取溶剂的浓度为80%、提取时间为2 h、料液比为1：25、提取温度为80℃。

野菊花总黄酮最佳提取工艺验证：取野菊花原料1.0 g，按料液比为1：25向其中加入80%醇25 mL，水浴回流温度为80℃，提取2 h，平行实验三次，结果见表3所列。相对标准偏差（RSD）值为0.89%，证明此提取工艺可行。

4结论

本研究利用乙醇法提取野菊花总黄酮，通过单因素分析和正交试验探究了野菊花总黄酮提取的影响因素和最佳工艺条件。结果表明，野菊花总黄酮提取的最佳工艺条件为提取溶剂乙醇浓度为80%、提取时间为2 h、料液比为1：25、温度80℃，此时黄酮的含量为49.01 mg/g，在该条件下，野菊花总黄酮的提取率最高，为4.90%。