瑶药满山香总黄酮提取工艺的优化

2020-11-09 03:07唐春丽魏江存陆梅元谢臻陈宏夏赵凤仙
湖北农业科学 2020年16期
关键词:总黄酮提取工艺

唐春丽 魏江存 陆梅元 谢臻 陈宏夏 赵凤仙

摘要:采用回流提取法提取满山香(Schisandra propinqua)总黄酮,通过单因素试验,考察提取方法、提取溶剂体积分数、提取液体积、提取时间对药材总黄酮含量的影响,采用正交试验,优化提取工艺条件,筛选出满山香总黄酮的最佳提取工艺。结果表明,满山香总黄酮的最佳提取工艺为60%乙醇、料液比1:40(m: V)、回流提取时间1.0 h。该方法能有效测定满山香药材总黄酮的含量,重复性较好、稳定可行。

关键词:满山香(Schisandra propinqua );总黄酮;提取工艺

中图分类号:R282 文献标识码:A

文章编号:0439-8114 (2020) 16-0126-04

DOI: 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.028

满山香来源于木兰科植物合蕊五味子[Schisandrapropinqua (WaII.) Baill. var. iutermdida A. C. Smith]的干燥藤茎和根,为广西常用药材,具有舒筋活血、消肿止痛的功能,用于治疗骨折、慢性胃肠炎、风湿性关节炎、痛经、外伤出血等病症[1,2]。以满山香为主要原料的灯银脑通胶囊用于中风中经络、瘀血阻络的治疗。目前,野生满山香植物资源种群稀少,蕴藏量小[3];瑶药满山香含有木脂素类[4-6]、黄酮类[7,8]、挥发性[1]等成分。黄酮类化合物是广谱生物活性物质,普遍存在于植物中,具有抗癌、防癌、抑菌、抗病毒、降低胆固醇等药理作用与生物活性,以及对内分泌系统[9]和免疫系统等有很好的保护作用[10-13]。

本研究以瑶药满山香总黄酮含量为指标,采用单因素试验考察了提取方法、提取溶剂体积分数、提取液体积、提取时间对提取满山香药材总黄酮含量的影响,并采用正交试验进一步优选最佳提取工艺,为进一步研究满山香药材的质量标准提供了一定的参考依据。目前,国内对满山香药材总黄酮含量测定的相关研究鲜见报道,为保证其药材质量及临床疗效,本试验建立满山香总黄酮的含量测定方法,为后期开发、利用其药用资源提供科学依据。

1材料与方法

1.1仪器

UV1780型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);XS105D型十万分之一天平(梅特勒-托利多称重设备系统有限公司);KQ5200B超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);数显电子恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司);优普ULUPURE实验室超纯水仪(上海优普实业有限公司)。

1.2 材料

芦丁,纯度>98%,购于上海融禾医药科技有限公司;甲醇、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等所用试剂均为分析纯。药材采摘于广西贺州市富川瑶族自治县,经广西中医药大学药学院陈勇教授鉴定为木兰科植物合蕊五味子,经52 ℃烘干,备用。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃干燥到恒重的芦丁对照品适量,加60%乙醇溶解,定容至25 mL容量瓶中,摇匀,制成浓度为0.4482 mg/mL的对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液制备 精密称取瑶药满山香药材粉末1.0 g,置于100 mL的锥形瓶中,加入25 mL体积分数为60%的乙醇,称定其重量,水浴回流提取1.0 h,再称定重量,使用60%乙醇补足减失的重量,摇匀,过滤,精密量取续滤液2.0 mL,置于50 mL容量瓶中,依据总黄酮的测定方法测定其吸光度,用线性方程求出样品溶液中总黄酮的含量,计算得到满山香药材总黄酮含量。

1.3.3 检测波长的选择 精密量取上述对照品溶液3 mL于25 mL容量瓶中,再加入1mL的5%亚硝酸钠溶液,轻轻摇匀,靜置6 min后加入1 mL的10%硝酸招溶液,摇匀,静置6 min,再加4%氢氧化钠溶液10 mL,再加水至刻度,摇匀,放置12 min,以相应试剂作空白,采用分光光度法在400~800 nm测定吸收光谱,其最大吸收波长为512 nm。

1.3.4 标准曲线的绘制 分别取“ 1.3.1”的对照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mL 于 25 mL 容量瓶中,加5%亚硝酸納0.4 mL,放置6 min后,加10%硝酸铅0.4 mL,放置6 min,再加4%的氢氧化钠4mL,加水至刻度,摇匀,放置10 min,然后在512 nm测定[18]。

1.3.5 单因素试验

1) 提取方法。取满山香药材粉末1.Og,精密称定,置于锥形瓶中,提取时间1 h、25 mL、60%乙醇为提取条件,分别采用超声提取法、回流提取法和浸渍法对药材进行总黄酮提取,考察不同提取方法对满山香总黄酮提取率的影响。

2) 乙醇溶剂体积分数。取药材粉末1.Og,精密称定,置于锥形瓶中,提取时间1.0 h、25 mL不同体积分数(30%、50%、60%、70%和85%)的乙醇溶剂为提取条件,采用回流提取法,分析乙醇溶剂不同体积分数对药材总黄酮提取率的影响。

3) 提取时间。取药材粉末1.Og,精密称定,置于锥形瓶中,以60%乙醇25 mL为提取条件,采用回流提取法,分析提取时间对药材总黄酮提取率的影响,设提取时间为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h。

4) 提取液体积。取药材粉末1.Og,精密称定,置于锥形瓶中,提取时间1h、60%乙醇为提取条件,采用回流提取法,分析乙醇不同体积对药材总黄酮提取率的影响,设计60%乙醇提取体积分别为20、30、40、50、60、70 mL。

以上单因素试验按“1.3.2”的操作步骤制备供试品,按“1.3.3”的方法显色测定。

1.3.6 正交试验设计 从中药满山香中提取药材总黄酮的方法主要为有机溶剂提取法。根据查阅的相关文献[14-17],本试验最终采取不同体积分数乙醇为溶剂的提取方法,根据单因素考察结果,设置乙醇体积分数(50%、60%、70%)、料液比(1:30、1:40、1:50,m:V,下同)、提取时间(1.0、1.5、2.0 h)这3个条件。根据正交设计助手软件,使用L9(34)正交试验设计方法,试验因素和水平见表1。

2结果与分析

2.1 线性方程的制定

以吸光度对芦丁溶液浓度绘制标准曲线,线性方程为y=13.042x-0.038 5,R2=0.999 1,在0.008964~?0.071712 mg/mL浓度与吸光度有良好的线性关系。

2.2方法学考察

2.2.1 精密度试验 精密称取满山香药材粉末1.0g,按“1.3.2”的操作步骤制备供试品,按“1.3.3”的方法显色测定。于512 nm波长下连续6次测定其吸光度,结果为1.06%,小于3.00%,表明该方法精密度良好。

2.2.2 稳定性试验 取满山香药材粉末1.0 g,精密称定,按照“1.3.2”的操作步骤制备供试品,按“1.3.3的方法显色测定,测定同一供试液在不同时间下的吸光度,于512 nm波长处分别在0、10、20、30、40、50、60 min测定吸光度,计算药材的RSD值为2.41%,小于3.00%,吸收度在60 min内基本不变,表明样品在60 min内基本稳定。

2.2.3 重复性试验 精密称取瑶药满山香药材粉末样品6份,每份约1.0 g,按“1.3.2”的操作步骤制备供试品,按“1.3.3”的方法显色测定。于512 nm波长处平行测定其吸光度,计算满山香药材总黄酮的平均含量为 22.78 mg/g,RSD 值为 2.79%,小于 3.00%,表明该方法重复性良好。

2.2.4 加样回收率试验 取同一批次已知总黄酮含量的满山香药材粉末(含量为22.78 mg/g)0.5 g,精密称定,共9份,分成3组,即低、中、高加样组(0.5 g药材总黄酮含量的80%、100%和120%加样,精密加入芦丁对照品,加样量分别为9.20、11.40、13.65mg),按“1.3.2”的操作步骤制备供试品,按“1.3.3”的方法显色测定。于512 nm波长处平行测定其吸光度,计算总黄酮的含量。由试验结果分析可知,满山香药材的低、中、高加样组总黄酮的平均回收率分别为 98.78%、100.56%、99.40%,RSD分别为 2.59%、2.04%、2.93% (n=3),表明该方法准确性良好,结果见表2。

2.3单因素试验结果

由图1可知,不同提取方法对满山香总黄酮提取率的影响中,回流提取法的提取率最高,故而选择回流提取进行后续试验。由图2可知,60%乙醇回流提取满山香叶总黄酮的提取率最高。不同提取时间对满山香总黄酮提取率的影响结果(图3)表明,提取时间为1.5 h时,总黄酮提取率最高。由图4可知,结果显示提取液体积为40 mL时,满山香总黄酮提取率最高。

2.4 正交试验结果与分析

2.4.1 正交试验结果 根据正交设计助手软件、正父试验结果(表3)和方差分析结果(表4)可知,以瑶药满山香总黄酮的含量为试验指标,由于各试验因素对满山香药材总黄酮提取效果的影响程度不同,乙醇体积分数和料液比对满山香总黄酮的提取工艺有显著影响,而提取时间对满山香总黄酮的提取工艺无显著影响,且各影响因素的大小顺序为料液比(5)>乙醇体积分数(4)>提取时间(C),考虑试验的效率、时间以及成本,故而选择提取时间为l.Oh,因此,本试验最理想的提取方案是,即乙醇体积分数是60%,料液比是1:40,回流提取时间是1.0 h,此时提取效果最佳。2.4.2验证试验精密称取满山香药材粉末3份,每份约1.0 g,置于锥形瓶中,测定其总黄酮含量,结果(表5)表明,采用正交试验优化的工艺提取满山香药材总黄酮,其含量平均值为23.53 mg/g,/^D為1.94%〇

3小结与讨论

本试验以满山香药材为研究对象,考察了乙醇体积分数、提取液体积和提取时间3个影响因素,瑶药满山香总黄酮的提取采用回流提取法,利用正交试验的方法优化瑶药满山香总黄酮的最佳提取工艺。前期研究发现,影响瑶药满山香总黄酮提取工艺的主要因素是溶剂体积分数、提取液体积和提取时间,根据试验影响因素的选择与确定,本试验采用L9(34)正交试验设计的方法,进行多次试验,结果分析表明,瑶药满山香的最佳提取工艺,即采用回流提取法,乙醇体积分数为60%,料液比为1:40,提取时间为1.0 h,此时瑶药满山香总黄酮提取效果最佳。

在单因素试验的基础上,通过正交试验,建立了满山香总黄酮提取率的工艺优化。方差分析表明,乙醇体积分数、料液比2个因子具有显著性,各因子对总黄酮含量影响的大小依次为料液比(B)>乙醇体积分数(A)>提取时间(C)。

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收稿日期:2019-11-15

基金项目:国家自然科学基金项目(81360524) ;2019年度广西高校中青年教师科研基础能力提升项目(2019KY0341);广西中医药大学青年基金项目(2019QN036);广西然科学基金项目(2014GXNSFAA118208);国家中医药管理局科研三级实验室中(壮)药化学与质量分析实验室(国中医药发2009[21]号)

作者简介:唐春丽(1980-),女,广西桂平人,副主任药师,硕士,主要从事中药质量分析及其药效机制研究,(电话)18978913964(电子信箱)12072982891@qq.com;通信作者,魏江存,药师,硕士,主要从事中药、民族药及其制剂质量分析和药效机制研究,(电子信箱)960837714@qq.com。

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