葫芦素B抑制JAK2/STAT3信号拮抗非小细胞肺癌H1975细胞增殖的研究

何臣 王菊辉 丘韶校 徐羽中 李元广

【摘要】 目的：证明葫芦素B通过影响JAK2/STAT3信号活化抑制非小細胞肺癌（NSCLC）H1975细胞增殖。方法：采用不同浓度葫芦素B作用于H1975细胞不同时间，采用CCK-8法测定细胞增殖抑制情况，采用PI染色法检测细胞周期分布，采用Western blot法测定EGFR、JAK2、STAT3蛋白表达。结果：葫芦素B浓度10、100、1 000 nmol/L作用24、48 h的细胞增殖抑制率均高于葫芦素B浓度0 nmol/L，其中1 000 nmol/L>100 nmol/L>10 nmol/L（P<0.05）。葫芦素B浓度10、100、1 000 nmol/L作用48 h的细胞增殖抑制率均高于作用24 h（P<0.05）。细胞增殖抑制率随着葫芦素B浓度增加和作用时间延长逐渐增高（P<0.05）。葫芦素B浓度100、1 000 nmol/L作用24、48 h的G2/M期阻滞率均高于葫芦素B浓度0、10 nmol/L，其中1 000 nmol/L>100 nmol/L（P<0.05）。葫芦素B浓度100、1 000 nmol/L作用48 h的G2/M期阻滞率均高于作用24 h（P<0.05）。G2/M期阻滞率随着葫芦素B浓度增加和作用时间延长逐渐增高（P<0.05）。葫芦素B浓度100、1 000 nmol/L作用H1975细胞后p-STAT3与p-JAK2的表达均低于葫芦素B浓度0、10 nmol/L，其中1 000 nmol/L>100 nmol/L（P<0.05）。结论：葫芦素B能够抑制H1975细胞增殖、阻滞细胞周期，其机制与葫芦素B抑制JAK2/STAT3信号活化有关。

【关键词】 非小细胞肺癌 葫芦素B JAK2 STAT3

[Abstract] Objective： To demonstrate that Cucurbitacin B inhibits non-small cell lung cancer （NSCLC） H1975 cell proliferation by influencing JAK2/STAT3 signaling activation. Method： H1975 cells were treated with different concentrations of Cucurbitacin B at different time periods， cell proliferation inhibition was determined by CCK-8 method， cell cycle distribution was detected by PI staining， and protein expressions of EGFR， JAK2， and STAT3 were determined by Western blot. Result： The inhibition rate of cell proliferation at Cucurbitacin B concentrations of 10， 100 and 1 000 nmol/L for 24 and 48 h were higher than those at concentration of 0 nmol/L， of which 1 000 nmol/L > 100 nmol/L > 10 nmol/L （P<0.05）. The inhibition rate of cell proliferation at Cucurbitacin B concentrations of 10， 100 and 1 000 nmol/L for 48 h were higher than those of 24 h （P<0.05）. The inhibition rate of cell proliferation increased gradually with the increase of Cucurbitacin B concentration and the prolongation of action time （P<0.05）. The arrest rate of G2/M phase at Cucurbitacin B concentrations of 100 and 1 000 nmol/L for 24 and 48 h were higher than those at concentration of 0 and 10 nmol/L， in which 1 000 nmol/L > 100 nmol/L （P<0.05）. The arrest rate in G2/M phase at Cucurbitacin B concentrations of 100 and 1 000 nmol/L for 48 h were higher than those at 24 h （P<0.05）. The arrest rate of G2/M phase increased gradually with the increase of Cucurbitacin B concentrations and the prolongation of action time （P<0.05）. The expression of p-STAT3 and p-JAK2 in H1975 cells at Cucurbitacin B concentrations of 100 and 1 000 nmol/L were lower than those in H1975 cells at concentration of 0 and 10 nmol/L， of which 1 000 nmol/L>100 nmol/L （P<0.05）. Conclusion： Cucurbitacinacin B can inhibit the proliferation and cell cycle of H1975 cells， and its mechanism is related to the inhibition of JAK2/STAT3 signal activation by Cucurbitacin B.

[Key words] Non-small cell lung cancer Cucurbitacin B JAK2 STAT3

First-authors address： Shenzhen Baoan Peoples Hospital， Shenzhen 518101， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.26.008

肺癌是肿瘤相关死亡率和全球发病率较高的癌症之一，在肺癌的所有类型中，80%以上是非小细胞肺癌（NSCLC）[1]。NSCLC发病隐匿，早期临床表现不典型，导致大多数NSCLC患者一经诊断即已失去手术根治机会。近年来放化疗、靶向治疗以及免疫药物治疗的临床应用取得了一定的进展，但NSCLC整体治疗效果欠佳，5年相对存活率仅为23%，严重危害人类生命健康[2]。因此，寻找新的NSCLC治疗靶点及药物成为中晚期NSCLC治疗中亟待解决的重要问题。

激活子3（STAT3）與转录信号转导子是激活子与转录信号转导子家族的重要成员，在肺癌等多种恶性肿瘤持续过度激活。持续活化的STAT3通过增强肿瘤细胞自身抗凋亡和抑制机体正常免疫监视、清除反应导致肿瘤异常增殖和治疗耐药，因此阻断STAT3信号的活化可能成为NSCLC新的治疗途径[3-11]。虽然基础研究已经展现了STAT3小分子、肽类和靶向沉默siRNA基因抑制剂的潜在临床治疗价值，但尚远未能进入临床常规应用。

我国中医学界运用葫芦素治疗慢性肝病及肝癌已有很长的历史，临床药用的葫芦素片为葫芦素B/E单体的复合制剂（其中葫芦素B占60%）。近期国内外的一些研究证实葫芦素B能够选择性阻滞STAT3信号通路活化，进而发挥其抗肿瘤活性[12-19]。因此，在本研究中通过观察各种浓度葫芦素B分别作用不同时间对人肺腺癌细胞（H1975细胞）的影响，包括细胞增殖、细胞周期及STAT3信号分子活化，旨在证明葫芦素B对NSCLC的治疗作用及机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人肺癌细胞株H1975购自美国国家细胞库（ATCC）;RPMI1640 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（美国Gibco公司）;葫芦素B（美国Sigma公司）;CCK-8检测试剂盒（日本同仁化学株式会社）;BCA蛋白定量试剂盒（美国Pierce公司）;抗人磷酸化及总EGFR、JAK2、STAT3抗体（美国Cell Signaling公司）;二氧化碳恒温细胞培养箱（美国Hera-eus公司）;酶标仪（芬兰Labsystem公司）;垂直电泳仪（美国Biorad公司）;KONDA2000凝胶成像系统（美国Eastman Kodak公司）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法检测细胞增殖 取对数生长期H1975细胞，采用胰酶消化制成浓度为3×104个/mL的细胞悬液，在96孔培养板中加入细胞悬液100 μL/孔，观察细胞贴壁后加入不同浓度（终浓度分别为0、10、1 000、1 000 nmol/L）的葫芦素B，各浓度均设置3个复孔，培养24、48 h后在96孔培养板中加入CCK-8溶液，20 μL/孔，孵育2 h，在酶标仪上450 nm处检测OD值，计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=（1-OD加药-本底/OD未加药-本底）×100%[20]。

1.2.2 PI染色法检测细胞周期分布 取对数生长期H1975细胞，采用胰酶消化制成浓度为5×105个/mL的细胞悬液，在6孔板中接种细胞悬液2 mL/孔，观察细胞贴壁后加入不同浓度的葫芦素B（终浓度分别为0、10、1 000、1 000 nmol/L），均设置3个复孔，培养24、48 h后，取细胞悬液1 mL离心、清洗、4 ℃固定过夜、清洗、离心，加入100 mg/mL的PI染液500 μL，其中RNA酶的浓度为50 μg/ml;避光染色，采用Multicycle软件进行G2/M期阻滞率分析。

1.2.3 Westem blot法检测EGFR、JAK2及STAT3蛋白的表达情况 取对数生长期H1975细胞，采用胰酶消化制成浓度为5×105个/mL的细胞悬液，在10 cm培养基上接种细胞悬液10 mL，观察细胞生长至80%时，采用含不同浓度葫芦素B（终浓度分别为0、10、1 000、1 000 nmol/L）的完全培养基培养6 h后收集细胞，提取总蛋白，采用Westem blot法检测总EGFR、JAK2与STAT3蛋白表达;应用KONDA2000凝胶成像系统成像，使用图像分析软件分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两组间比较采用SNK检验，多组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 葫芦素B对H1975细胞增殖的抑制作用 葫芦素B浓度10、100、1 000 nmol/L作用24、48 h的细胞增殖抑制率均高于葫芦素B浓度0 nmol/L，其中1 000 nmol/L>100 nmol/L>10 nmol/L，差异均有统计学意义（P<0.05）。葫芦素B浓度10、100、1 000 nmol/L作用48 h的细胞增殖抑制率均高于作用24 h，差异均有统计学意义（P<0.05）。细胞增殖抑制率随着葫芦素B浓度增加和作用时间延长逐渐增高（P<0.05）。见表1。

2.2 浓度不同的葫芦素B作用对H1975细胞周期分布的影响 葫芦素B浓度100、1 000 nmol/L作用24、48 h的G2/M期阻滞率均高于葫芦素B浓度0、10 nmol/L，其中1 000 nmol/L>100 nmol/L，差异均有统计学意义（P<0.05）。葫芦素B浓度100、1 000 nmol/L作用48 h的G2/M期阻滞率均高于作用24 h，差异均有统计学意义（P<0.05）。G2/M期阻滞率随着葫芦素B浓度增加和作用时间延长逐渐增高（P<0.05）。见表2。

2.3 不同濃度葫芦素B对H1975细胞JAK2、STAT3、EGFR蛋白表达的影响 葫芦素B浓度100、1 000 nmol/L作用H1975细胞后p-STAT3与p-JAK2的表达均低于葫芦素B浓度0、10 nmol/L，其中1 000 nmol/L>100 nmol/L，差异均有统计学意义（P<0.05）。不同浓度葫芦素B浓度作用H1975细胞后对p-EGFR、EGFR、JAK2以及STAT3蛋白表达无明显的影响（P>0.05）。见表3和图1。

3 讨论

葫芦素是长期广泛应用的抗炎保肝中草药成分。文献[18，21]均分别发现葫芦素B及其半合成衍生物DACE能够诱导A549细胞增殖、G2/M细胞周期抑制，其作用机制是通过抑制STAT3蛋白的激活实现。目前国内外研究结果表明，葫芦素B对STAT3分子磷酸化有很强的阻断作用，并且能够抑制肿瘤活性[13-19]。本研究结果显示，葫芦素B呈剂量和时间依赖性抑制H1975细胞的细胞增殖，并诱导细胞周期停滞于G2/M期;进一步的免疫印迹法检测发现100 nmol/L浓度以上葫芦素B作用后H1975细胞后磷酸化STAT3的表达明显受抑制。说明葫芦素B能够抑制细胞增殖、影响细胞周期分布，使相应细胞周期停滞于G2/M期，细胞增殖受抑，从而能够抑制肿瘤的生长和进一步发展，与近年来国内外同类型的研究结论相同。

单体的STAT3分子无活性，可通过受体或非受体通路依赖两种经典途径活化，活化后的STAT3分子形成二聚体，其能够迅速进入细胞核，然后与特定的DNA结合，从而调控相应蛋白的表达，进而发挥生物学功能。第一种途径为可通过直接活化自身酪氨酸残基的活化途径，这种活化是需要经过具有自身酪酸激酶活性的EGFR等受体与配体结合后进行;第二种途径为通过募集激活JAK家族成员的活化途径，需要与相应的配体结合后从而募集激活JAK家族成员，然后通过JAK激酶的作用，激活STAT3。本研究采用免疫印迹法检测不同浓度的葫芦素B作用H1975细胞后，H1975细胞的磷酸化及总JAK2、EGFR蛋白的表达与既往报道文献[22]类似，本研究也发现经100 nmol/L浓度以上葫芦素B处理后H1975细胞p-JAK2信号激活产生不同程度的抑制作用，这种抑制与p-STAT3信号激活相关，表现为正相关;而对H1975细胞的p-EGFR及总EGFR蛋白的表达不明显，说明葫芦素B影响H1975细胞的机制与细胞的JAK2/STAT3信号转导通路受抑制紧密相关，而这种信号转导通路是EGFR非依赖性的。

综上所述，葫芦素B在靶向抑制JAK2/STAT3信号通路中具有强大的药理学作用，其机制是通过葫芦素B的信号分子导航选择性抑制人非小细胞肺癌H1975细胞中异常活化的STAT3的信号传导，介导人非小细胞肺癌H1975细胞细胞增殖抑制和G2/M细胞周期阻滞，然后发挥抗肿瘤作用，为非小细胞肺癌的治疗提供新的选择。

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（收稿日期：2020-02-28） （本文編辑：田婧）