中性粒细胞胞外诱捕网在痛风中的作用

潘迎紫 吴玉寒 褚赞波 邹荣鑫 李晓可 陈勇

【摘要】 痛风是一种常见的慢性炎症性疾病，以其急性发病中的红肿热痛为特征，但它能在几天内自行消退，这其中的发病过程非常复杂。近年来中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）作为一种新的抗炎机制，被发现在痛风的炎症消退反应中也起着重要的作用。在这篇综述中，笔者将讨论在痛风炎症机制中与NETs相关的细胞因子、NETs的经典释放途径以及其在痛风炎症反应中的作用。研究NETs的作用将有助于开发新的治疗方法。

【关键词】 中性粒细胞胞外诱捕网 网捕死亡 痛风 NETs聚集物

[Abstract] Gout is a common chronic inflammatory disease characterized by red， swelling， hot and pain in its acute attack， but it can subside spontaneously within a few days， the pathogenesis of the subsidence is very complex. In recent years， as a new anti-inflammatory mechanism， neutrophil extracellular traps （NETs） has been found to play an important role in the inflammatory subsidence of gout. In this review， we will discuss the cytokines associated with NETs in the inflammatory mechanism of gout， the classical release pathways of NETs， and their roles of NETs in the inflammatory response of gout. Studying the role of NETs will help to develop new therapies.

[Key words] Neutrophil extracellular traps NETosis Gout NETs aggnets

First-authors address： Ningbo University School of Medicine， Ningbo 315000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.26.042

痛风是一种常见的慢性炎症性疾病，其主要临床特征表现在机体对单钠尿酸盐（monosodiumurate，MSU）晶体的炎症反应，大致可分为4个阶段，即无症状性高尿酸血症期、急性发作期、间隙期以及痛风石和慢性痛风关节炎期。尿酸在体内是以离子形式的尿酸盐存在，当血清尿酸水平大于正常阈值时，MSU晶体开始在组织中沉积，关节内MSU晶体持续沉积引发急性炎症反应，同时伴有严重的关节疼痛、肿胀、发热、发红以及受累关节活动困难，发作时可出现轻度关节不适或刺痛的前期症状，通常在24 h内达到峰值。

1 中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）

1.1 定义 NETs指含有DNA、组蛋白和中性粒细胞蛋白质的细胞外结构，其中的蛋白质如骨髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）或钙粒蛋白。在NETs的形成过程中，中性粒细胞通过蛋白酶处理组蛋白进行染色质重构，重构的染色质随后结合抗菌蛋白和酶。然后，经过修饰的染色质通过一个称为“网捕死亡”（NETosis）的过程释放出来。NETs形成这一新形式的细胞死亡过程被称为“网捕死亡”。NETs出现在炎症部位，并可能由于局部DNA酶的降解导致寿命很短，因此检测和量化NETs很困难[1]。

1.2 与中性粒细胞胞外诱捕网有关的细胞因子

1.2.1 白细胞介素-1β（IL-1β） IL-1β是一种固有免疫反应中的细胞因子，作用于多种细胞类型以引发炎症反应。在痛风中，活性IL-1β主要是由MSU晶体触发caspase-1以激活NALP3炎症小体从而诱导产生的[2]。鉴于IL-1β在痛风发病机制中的重要作用，Mitroulis等[3]研究了抑制IL-1信號转导对“NETs”形成的影响，该研究发现重组IL-1受体拮抗剂阿那白滞素（anakinra）大部分能抑制急性痛风患者血清中“NETs”的生成。为了区分阿那白滞素的作用是由于IL-1α或IL-1β信号的抑制，在刺激对照多形核白细胞（PMNs）之前，用抗IL-1β单克隆抗体（mab）处理离心滑液，得到抗IL-1β和阿那白滞素治疗都有相似的抑制作用。此外，用重组IL-1β培养对照PMNs可诱导形成NETs[3]。

1.2.2 白细胞介素-8（IL-8） IL-8是一种趋化因子，在中性粒细胞活化和炎症部位的募集中起着重要作用。它能刺激PMNs的黏附、脱粒和呼吸爆发。IL-8还具有吸引和激活单核细胞的能力，特别是在癌症中，它不断地产生并能刺激血管的生成[4]。

由于NETs是由激活的中性粒细胞形成的，可以推测IL-8可能参与NETs的形成。有研究表明，IL-8影响了NETs的形成，Brinkmann等[5]发现被IL-8激活的中性粒细胞能够形成NETs。在其他特殊情况下，IL-8也可以参与NETs形成。胎盘来源的IL-8和合体滋养层膜微粒（STBM）能够独立地刺激中性粒细胞，导致体外NETs的发育[6]。Alfaro等[7]发现肿瘤源性IL-8可诱导粒细胞人骨髓源性抑制细胞（MDSC）从而形成NETs。

1.2.3 白细胞介素-18（IL-18） IL-18可由多种组织细胞产生，能诱导Th1细胞产生细胞因子（IFN-γ、IL-2、GM-CSF），能激活NK细胞的细胞毒活性，并能促进T细胞增殖。在痛风中，MSU参与caspase-1介导促炎性细胞因子IL-18的分泌，并促进细胞的炎症发展。Jorgensen等[8]发现IL-18能够通过调节中性粒细胞从而影响NETs的形成，而PMNs能有效地促进NETs的发展并消除感染。

1.2.4 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α） TNF-α是一种由激活的巨噬细胞产生的能抑制成骨细胞和刺激破骨细胞的细胞因子，具有杀伤靶细胞和促进细胞凋亡，参与局部炎症和内皮细胞活化的作用。研究发现，TNF-α可以促进实验性痛风中pro-IL-1β mRNA和IL-1β蛋白的表达，其跨膜形式足以引发MSU诱导的小鼠炎症，同时在痛风患者中也可以检测到TNF-α[9]。

相关研究表明，用TNF-α治疗健康受试者的中性粒细胞可增强自由基的生成和“NETs”结构的形成，这是通过激活NADPH氧化酶和MPO介导的[4]。同时发现TNF-α是PMNs功能的有效激活剂，重组人肿瘤坏死因子刺激中性粒细胞呼吸爆发以及溶菌酶释放，显著提高了中性粒细胞对趋化肽（n-formyl-met-leu-phe，FMLP）的呼吸反应[4]。所以不难得出TNF-α也参与NETs的形成。

可见在痛风发病机制中一些起着重要作用的细胞因子，如IL-1β、IL-8、IL-18与TNF-α共同参与NETs的形成及发展。

1.3 NETs释放的经典途径 “网捕死亡”的发生需要蛋白酶和活性氧。NETosis需要以下步骤：（1）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶产生活性氧（ROS）;（2）中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）和髓过氧化物酶（MPO）从颗粒转移到细胞核;（3）精氨酸残基在核内转化为瓜氨酸。一种被称为“azurosome”的复合蛋白质通过髓过氧化物酶（MPO）感知过氧化氢，它将活性氧转化为卤酸[10]。髓过氧化物酶的激活导致中性粒细胞颗粒的通透性增加和“azurosome”的解离。这一过程导致丝氨酸蛋白酶以及中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的释放，它们转移到细胞核内去剪辑组蛋白[11]。肽基精氨酸脱氨酶-4（PAD4）是一种钙依赖性酶，瓜氨酸精氨酸和甲基精氨酸残基在组蛋白上。瓜氨酸化过程（即正电荷精氨酸向中性电荷氨基酸瓜氨酸的转化）导致静电吸引的损失[12]，因此核染色质会解聚，而染色质是NETs形成所必需的[13]。重要的是，NETs将髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、组织蛋白酶G、丝氨酸蛋白酶3（PR3）和抗菌肽LL-37等几种酶以及组蛋白暴露在细胞外空间。这些蛋白质和其他蛋白质使“NETs”能够发挥其在微生物防御、凝血和免疫激活方面的作用。

2 中性粒细胞胞外诱捕网与痛风

2.1 痛风 痛风是由针状尿酸单钠晶体（MSU）积聚引起的急性炎症性关节炎。大脚趾或肾脏等关节处的晶体沉积引发炎症事件，炎症事件迅速发展，然后消退。中性粒细胞在痛风急性炎性发作进展和缓解中的作用尚不清楚。局部免疫细胞（包括巨噬细胞、树突状细胞和滑膜细胞）激活后，中性粒细胞显著涌入受影响关节的滑膜[14-15]。然后这些细胞吞噬MSU晶体，从而产生活性氧并启动炎症途径。炎症因子的激活和IL-1β的释放招募了中性粒细胞和额外的免疫细胞。这些细胞产生趋化因子，进而加剧中性粒细胞的招募。这些中性粒细胞产生活性氧并释放抗菌肽，如IL-1β和IL-8[16]。

2.2 痛风中NETs的形成 痛风中NETs的释放是非常复杂的，并且受多种机制调控。从痛风患者中分离出的中性粒细胞能自发性地释放NETs，痛风患者的血清能够诱导健康捐赠者的NETs的形成。由于多种细胞因子可诱导NETs形成，Mitroulis等[3]首先表明痛风和NETs有关系，NETs是以MSU晶体作为刺激物形成的。白细胞介素-1（IL-1）试图在NETs生成过程中发挥关键作用，因为IL-1受体拮抗剂阿那白滞素减少了NETs的生成[3]。Schorn等[17]表明MSU诱导的“网捕死亡”是由活性氧（ROS）介导的，活性氧是由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH）介导的，线粒体活性氧的激活和释放是“网捕死亡”的关键，由于NETs是由核内结构组成的，长期暴露NETs会增加自身免疫性的风险。

Sil等[18]证实了MSU诱导“网捕死亡”的另一个途径，可能涉及巨噬细胞释放的IL-1β来启动“网捕死亡”。另外一个研究发现中性粒细胞需要尝试吞噬MSU晶体，以便进行随后的NETs释放并形成NETs聚集物（aggnets）[19]。中性粒细胞并不真正吞噬MSU晶体，因为大多数晶体比中性粒细胞本身长得多。数据表明，只有一小部分参与MSU晶体吞噬及NETs释放的PMN与MSU晶体相关[19]。这让笔者得出这样的结论：MSU晶体被吞噬是形成NETs的先决条件。聚集物的形成同时依赖活性氧（ROS）。进一步的研究提供了对MSU诱导的NETs机制的新见解，一些抑制P2Y受体的物质，如苏拉明、PPADS和MRS2578可以限制MSU介导的NET的形成[19]。

2.3 NETs在痛风炎症反应中的作用

2.3.1 NETs的促炎作用 炎症激活后大量招募到痛风患者关节的中性粒细胞（PMN）会遇到MSU晶體，激活的中性粒细胞形成NETs。急性痛风时中性粒细胞的激活伴随炎症相关疼痛[20]。尽管NETs对宿主防御有好处，但其发生的代价是损害宿主的组织，因为NETs的成分，特别是组蛋白，可以引起对内皮细胞的损伤[21]。NETs是否有助于痛风发作的这一阶段仍有待阐明，但很可能是因为通过形成了NETs，中性粒细胞会释放出它们的危险颗粒。

2.3.2 NETs聚集物的消炎作用 炎癥部位的活化中性粒细胞释放大量促炎介质，吸引并激活更多的粒细胞和其他免疫细胞。为了避免细胞激活和介质释放的正反馈循环，需要严格控制这些过程。这种控制被认为主要通过诱导中性粒细胞凋亡和巨噬细胞吞噬作用的发挥[22]，导致中性粒细胞清除和释放TGF-β等抗炎细胞因子。然而有报道称，中性粒细胞在消炎过程中起着积极的作用，在这项研究中发现在高密度的中性粒细胞的条件下，由MSU晶体诱导的形成NETs更大的NETs聚集物[23]。聚集物致密地包裹MSU晶体，并通过固有的蛋白酶捕获和降解促炎介质。

另外一项研究表明，与NADPH无关的“网捕死亡”发生在对MSU结晶的反应中。MSU晶体与溶酶体相互作用，中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）介导的染色质去密度在细胞死亡时发生，由此产生的NETs可能会将DNA涂层的MSU晶体隔离在痛风石中[24]。因此，中性粒细胞也可能在痛风炎症的快速消退中发挥作用。但这种解决办法不会导致MSU晶体的清除，因为它们在炎症消散后仍留在受影响的关节中。

NETs聚集物的产生能够给无症状-炎症的MSU晶体的沉积提供一个支柱。而且，MSU晶体的沉积能通过双能CT观察到。这种疾病状态称为慢性痛风[25]。然而，痛风研究的这一领域仍有待证实明确。此外，NETs聚集物中的蛋白酶降解IL-6、TNF和巨噬细胞炎症蛋白1α（MIP1α，也叫作CCL3）。因此，通过捕获MSU和降解促炎细胞因子，MSU晶体和NETs在受影响区域的积累是炎症消退的核心。值得注意的是，由于很难重现NETs聚集物降解细胞因子的数据，所以2016年的一项研究对中性粒细胞在痛风消退中的作用提出了挑战[26]。

2.3.3 促炎及抗炎的分界点 Christine等发现MSU诱导的“NETosis”在产生活性氧（ROS）之前，导致中性粒细胞释放促炎性介质[23]。相反，在痛风性关节炎的滑液或密集浸润的炎性组织中，中性粒细胞密度较高，在体外和体内形成“aggnets”，从而产生抗炎作用[25]。所以可以猜测，多形核细胞在低细胞密度下进行促炎性“NETosis”，而在高细胞密度下形成抗炎性“aggnets”。但是到目前为止中性粒细胞的聚集和“NETs”形成之间的联系仍然难以确定。中性粒细胞似乎在痛风发作的炎症阶段是有害的，但它们帮助炎症消退的这一能力不能被忽视，仍需要进一步研究。

越来越多的证据表明，中性粒细胞参与了风湿病的进展，特别是“网捕死亡”的过程。痛风时，发炎是由于尿酸以针状MSU晶体的形式沉淀而引起的。这些晶体在局部免疫细胞中的炎症激活导致了中性粒细胞的迅速而剧烈的募集。在急性痛风发作期间，中性粒细胞的涌入伴随着极其强烈的炎症临床症状。但是，中性粒细胞性炎症有一个内置的保护装置，激活的中性粒细胞形成中性粒细胞胞外诱捕网。在炎症部位出现非常高的中性粒细胞密度下，形成NETs聚集物，致密地包裹MSU晶体，并通过固有的蛋白酶捕获和降解促炎介质。通过聚集物局部去除细胞因子和趋化因子可以解释急性炎症如何在炎症触发器的存在下停止。许多研究已经证明患者受影响的组织中存在NETs物质，自身抗体通常针对中性粒细胞蛋白，而中性粒细胞蛋白是已知的在“网捕死亡”过程中释放的。证据还表明，中性粒细胞是消炎所必需的。然而，关于NET释放的机制仍然存在许多未解决的问题。总的来说，进一步研究NETs的作用将有助于开发新的治疗方法。

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（收稿日期：2020-02-27） （本文編辑：张爽）