三种抗生素对西花蓟马存活率及肠道可培养细菌的影响

叶佳琴，郅军锐，曾 广，张 涛，黄 宸，周 丹

(贵州大学昆虫研究所，贵州省山地农业病虫害重点实验室，贵阳 550025)

昆虫体内栖息着大量微生物，包括细菌、古菌、原生生物和真菌等，其中99.00%以上属于细菌(Egertetal., 2003; 梅承等, 2018)。这些细菌栖居在肠道内并参与宿主的生理反应，与宿主相互依赖，互惠共生(Dale, 2006; Shaoetal., 2017)，某些特殊的细菌在宿主的营养吸收、发育繁殖、抵御病原菌以及抗药性等方面起着重要作用(Philipp and Moran, 2013)，因此研究昆虫肠道细菌对于益虫的保护以及害虫的综合治理具有重要的意义。使用抗生素去除肠道细菌是一种行之有效且操作容易的方法，并为进一步验证肠道细菌的功能奠定了基础。Lin等(2015)研究发现，利福平和硫酸链霉素可不同程度的去除小菜蛾Plutellaxylostella的肠道细菌，导致小菜蛾较高的死亡率；四环素、氨苄青霉素和利福平等可有效去除B型和Q型烟粉虱Bemisiatabaci肠道共生菌Hamiltonella(Ruan, 2010; 苏奇等, 2012)；利福平、盐酸土霉素和青霉素G钾盐可以有效减少大青叶蝉Cicadellaviridis内共生菌Sulciamuelleri(练启仙等, 2019)。使用氯霉素、氨苄青霉素和硫酸链霉素等抗生素以不同方式饲喂黑豆蚜Aphiscraccivora后可获得脱共生菌的蚜虫(苗雪霞, 2004)。

西花蓟马Frankliniellaoccidentalis(Pergande)属缨翅目Thysanoptera蓟马科Thripidae花蓟马属Frankliniella，是一种世界性的入侵害虫(雷仲仁等, 2004; 吴青君等, 2005)。具有个体小，易隐匿，繁殖力强和食性广等特点，可取食60个科250种作物(Reitzetal., 2019)。西花蓟马可通过直接取食和产卵造成危害，也可间接传毒危害，对农业生产造成了不可估量的经济损失(Pappuetal., 2009; Yulinetal., 2012; 谢永辉等, 2013)。西花蓟马已对多种农药产生了不同程度的抗药性，使其防治变得更加困难。

De Vries等(2001a)通过显微镜观察、传统培养和API-20E肠道菌试剂鉴定等方法确定西花蓟马后肠内存在大量的细菌，属于欧文氏菌属Erwinia。西花蓟马若虫通过取食获得细菌且在2龄时带菌率为100.00%，在预蛹和蛹期带菌率有所下降，但成虫期又明显升高(De Vriesetal., 2001b)。肠道细菌可以使西花蓟马种群产卵率增高、成熟时间缩短(De Vriesetal., 2004)。去除西花蓟马的肠道细菌，能否影响西花蓟马种群数量或降低西花蓟马的存活率？为此本试验利用薄膜饲喂法和叶片浸渍法对氨苄青霉素、硫酸链霉素和氯霉素3种常用抗生素处理西花蓟马，以明确抗生素处理后对西花蓟马毒害作用以及肠道细菌的去除效果，并为进一步明确肠道菌的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 抗生素

氨苄青霉素、硫酸链霉素和氯霉素，购买于生工生物工程(上海)股份有限公司，化学纯研究专用抗生素。

1.2 供试昆虫和植物

供试昆虫：西花蓟马，采自贵州省贵阳市花溪区周边蔬菜上，并在实验室人工气候箱(温度25±1℃，RH 65%～70%，光照周期14 L ∶10 D)内用菜豆豆荚长期饲养。

供试植物：矮生菜豆Phaseolusvulgaris(泰国地豆王品种)种植在人工气候室中(温度25±1℃，RH 70%±5%，光照周期14 L ∶10 D)，以营养钵进行培育，菜豆长至两真叶后备用。菜豆植株生长期间未受到任何损伤和病虫危害。

1.3 抗生素的配制

称取一定粉末状的氨苄青霉素和硫酸链霉素用无菌水进行配制，氯霉素用少量的无水乙醇进行溶解再用无菌水进行配制，3种抗生素均配制成100.00 mg/mL母液备用。使用时根据需求将母液分别稀释成50.00 mg/mL，25.00 mg/mL和12.50 mg/mL浓度，所选浓度根据查阅文献和预实验获得，所配制的抗生素溶液置于-20℃保存。

1.4 抗生素不同处理方法

薄膜饲喂法处理，将冲洗干净的菜豆叶片晾干后用研钵研磨成汁液，用300目纱布过滤获得叶片汁液，取汁液与抗生素按所需浓度配制成液态饲料，置于-20℃保存备用。西花蓟马饲喂参考Murai装置稍作改进(Murai and Ishii, 1982)，使用长为4 cm双通的透明玻璃管，一端用300目纱布封口便于透气，另一端用双层Parafilm制成取食膜系统。

叶片浸渍法处理，参照Lin等(2015)方法，将采回的大小基本一致菜豆叶片洗净晾干备用，将晾干的叶片置于3种不同浓度的抗生素溶液中浸泡10 s后取出晾干，然后将晾干的叶片置于底部垫有湿润滤纸的9 cm培养皿中。

两种方法均接入30头西花蓟马成虫，每种抗生素的每个浓度设置4个重复，两种方法处理下，叶片浸渍法中对照以无菌水浸泡菜豆叶片，薄膜饲喂法中以在菜豆汁液中加入无菌水作为对照，每隔24 h更换新鲜液态饲料和叶片。处理后的西花蓟马放入人工气候箱中(条件同上)，分别在处理后24 h、48 h和72 h调查西花蓟马的存活情况。

1.5 西花蓟马肠道可培养细菌的培养

取上述两方法中氨苄青霉素和硫酸链霉素处理72 h和氯霉素处理24 h后存活的西花蓟马15头，先用75%酒精浸泡处理10 s，再用无菌水清洗3次，去除虫体残留酒精，然后在超净工作台中切取西花蓟马腹部置于1.5 mL离心管中，用消毒好的研磨棒磨碎后，加入600 μL无菌水摇匀制成菌液。取100 μL涂LB平板(LB培养基：NaCl 10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，15.0 g/L琼脂粉)，37℃培养24 h后观察肠道可培养细菌的生长情况。

1.6 数据处理及分析

使用Excel 2013和SPSS 21.0软件对抗生素处理后西花蓟马的死亡率进行数据统计和分析。死亡率经反正弦转换后，用Tukey检验法比较不同处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 薄膜饲喂法处理下抗生素对西花蓟马死亡率的影响

薄膜饲喂法处理结果表明，不同抗生素的浓度对西花蓟马有一定致死作用(表1)。不论是对照还是氨苄青霉素所有浓度处理，西花蓟马死亡率均随处理时间延长而明显升高，其中50.00 mg/mL氨苄青霉素处理72 h时西花蓟马死亡率最高，分别是处理24 h和48 h的7.64倍和1.69倍。硫酸链霉素在12.50 mg/mL和25.00 mg/mL浓度处理下，西花蓟马的死亡率随处理时间延长而升高，50.00 mg/mL处理下48 h和72 h间没有明显的差异。氯霉素的所有浓度处理在48 h和72 h没有显著差异且均高于24 h，其中25.00 mg/mL氯霉素处理下48 h和72 h西花蓟马死亡率均是24 h的1.45倍。

在同一时间下，西花蓟马死亡率随浓度增加而升高，但不同抗生素处理下升高程度不同。3种抗生素处理24 h时25.00 mg/mL和50.00 mg/mL浓度死亡率无显著差异，但均高于12.50 mg/mL和对照。氨苄青霉素处理后不论在48 h还是72 h，均是50.00 mg/mL西花蓟马死亡率最高为25.67%和43.33%，分别是对照的3.21和3.61倍。硫酸链霉素处理48 h时，随浓度增加西花蓟马死亡率不断升高，在50.00 mg/mL时达到40.00%，为对照的5.00倍，72 h下50.00 mg/mL死亡率最高为44.67%，比对照提高了32.67%。氯霉素处理后不论是48 h还是72 h西花蓟马的死亡率在3个浓度下没有明显的差异，但均明显高于对照，其中48 h时西花蓟马死亡率在12.50 mg/mL浓度时为95.33%，是对照的11.92倍，浓度为25.00 mg/mL和50.00 mg/mL时西花蓟马死亡率为100.00%为对照的8.33倍。

2.2 叶片浸渍法处理下抗生素对西花蓟马死亡率的影响

叶片浸渍法处理结果表明在同一抗生素不同浓度下，西花蓟马累计死亡率随着时间延长而升高(表2)，浓度为50.00 mg/mL氨苄青霉素在48 h 和72 h西花蓟马死亡率没有显著差异，对照和其余浓度下西花蓟马死亡率均为72 h显著高于24 h和48 h，其中25.00 mg/mL氨苄青霉素处理下西花蓟马死亡率72 h分别为24 h和48 h的6.67倍和2.00倍。硫酸链霉素处理24 h后，西花蓟马死亡率在25.00 mg/mL和50.00 mg/mL 2个浓度下没有差异，但明显高于对照和12.50 mg/mL处理，在48 h时各浓度之间西花蓟马死亡率无差异，但显著高于对照，在72 h时，死亡率在50.00 mg/mL为36.67%。氯霉素处理后，在24 h和48 h时西花蓟马的死亡率均随浓度增加而升高，在72 h时西花蓟马死亡率在浓度为50.00 mg/mL时最高为97.67%。

表1 薄膜饲喂法处理下抗生素对西花蓟马死亡率(%)的影响

在相同时间下随着浓度增加西花蓟马死亡率升高，氨苄青霉素处理24 h和72 h时，西花蓟马死亡率在25.00 mg/mL和50.00 mg/mL 2个浓度间没有差异，但显著高于对照和12.50 mg/mL处理，其中72 h时氨苄青霉素25.00 mg/mL和50.00 mg/mL时西花蓟马死亡率分别为对照的1.82倍和2.52倍，在48 h时，氨苄青霉素50.00 mg/mL处理下西花蓟马死亡率最高为20.00%，是对照的3.53倍。硫酸链霉素处理24 h后，西花蓟马死亡率在25.00 mg/mL和50.00 mg/mL 两个浓度下没有差异，明显高于对照和12.50 mg/mL处理，48 h时各浓度之间西花蓟马死亡率无差异，但显著高于对照，72 h时，西花蓟马的死亡率在50.00 mg/mL为36.67%，为对照的3.33倍。氯霉素处理后，在24 h和48 h时西花蓟马的死亡率均随浓度增加，死亡率明显升高，在72 h时西花蓟马死亡率在浓度为50.00 mg/mL时为97.67%为对照的8.88倍。

薄膜饲喂法和叶片浸渍法饲喂抗生素后，西花蓟马累计死亡率在2种处理方式下不同。在相同浓度和时间下均为薄膜饲喂法>叶片浸渍法。其中50.00 mg/mL氨苄青霉素处理后，薄膜饲喂法下西花蓟马死亡率为叶片浸渍法的1.57倍。50.00 mg/mL链霉素处理后，薄膜饲喂法下造成西花蓟马死亡率是叶片浸渍法的1.90倍。50.00 mg/mL氯霉素处理后，薄膜饲喂法下造成西花蓟马死亡率比叶片浸渍法提高了41.00%。

2.3 薄膜饲喂法处理下抗生素对西花蓟马肠道细菌的去除效果

由于氯霉素的任何浓度在两种处理方式下导致西花蓟马死亡率较大，48 h和72 h时使得剩余虫量较少不足以进行肠道内细菌的培养，为验证氯霉素对西花蓟马肠道可培养细菌的去除效果，因此本文选择氯霉素处理西花蓟马24 h后进行肠道可培养细菌的去除效果实验，选择氨苄青霉素和硫酸链霉素2种抗生素处理72 h后对西花蓟马肠道细菌的去除实验。薄膜饲喂法研究结果显示，3种抗生素处理对西花蓟马肠道细菌有不同程度的抑菌作用(图1)。取食12.50 mg/mL和25.00 mg/mL浓度的氨苄青霉素西花蓟马肠道可培养细菌相对较少，在50.00 mg/mL时可培养细菌丰度与对照基本相同。取食含硫酸链霉素液态饲料的西花蓟马肠道可培养细菌数量随浓度的增加而减少，且在50.00 mg/mL时可培养细菌几乎全部被抑制。氯霉素处理西花蓟马24 h后，西花蓟马肠道可培养细菌在浓度12.50 mg/mL和25.00 mg/mL时与对照类似，在浓度50.00 mg/mL时可培养细菌与对照相比受到抑制，但未能完全去除。

表2 叶片浸渍法处理下抗生素对西花蓟马死亡率(%)的影响

图1 抗生素薄膜饲喂法对西花蓟马肠道可培养细菌的去除效果Fig.1 Effect of antibiotics on the removal gut culturable bacteria in Frankliniella occidentalis at membrane feeding method

2.4 叶片浸渍法处理抗生素对西花蓟马肠道细菌的去除效果

叶片浸渍法研究结果表明，对照的可培养细菌丰度明显高于氨苄青霉素和硫酸链霉素2种抗生素处理组，且不同抗生素抑菌效果存在差异(图2)。氨苄青霉素处理显示，在浓度为25.00 mg/mL时抑菌效果较好，仅观察到少数菌落，在50.00 mg/mL和12.50 mg/mL时均与对照类似。硫酸链霉素处理下，随着浓度的增加，西花蓟马肠道可培养细菌丰度降低，仅在LB培养基中观察到少量菌落。氯霉素处理24 h后，西花蓟马肠道可培养细菌在任何浓度下均与对照类似。

3 结论与讨论

本研究表明，西花蓟马在3种抗生素3个浓度处理下均随时间的延长累计死亡率升高，但死亡率的大小与抗生素的处理方式、种类和浓度密切相关。同一抗生素不同浓度处理对西花蓟马致死率均在24 h时不同浓度之间的差异较小，随时间延长，不同浓度造成的死亡率差异变大。前人也有类似的发现，如Lin等(2015)研究表明随着利福平和硫酸链霉素浓度增加对小菜蛾毒害作用增大死亡率升高；Vistto等(2009)研究不同抗生素对大豆夜蛾Anticarsiagemmatalis肠道细菌的抗敏感性发现增加四环素的浓度造成大豆夜蛾更高的致死率。本研究还发现不同抗生素对西花蓟马死亡率为氯霉素>硫酸链霉素>氨苄青霉素。林晓丽等(2014)的研究也表明，不同抗生素对小菜蛾的致死作用不同，并且硫酸链霉素处理组致死率较低。

图2 抗生素叶片浸渍法饲喂对西花蓟马肠道可培养细菌去除效果的影响Fig.2 Effect of antibiotics on the removal gut culturable bacteria in Frankliniella occidentalis at leaf dipping method

同种抗生素不同的处理方式会产生不同的致死效果。在本研究中3种抗生素相同时间和浓度下西花蓟马致死率均是薄膜饲喂法高于叶片浸渍法。可能是因为薄膜饲喂法取食系统是将叶片研磨、过滤取其汁液和抗生素一同配置成较均匀的液态饲料，因此西花蓟马锉吸能很好的获得液态饲料中的抗生素。而叶片浸渍处理，抗生素主要存在叶片表面，渗透到叶肉组织中的含量较少，从而导致以锉吸叶肉细胞液为主的西花蓟马仅能取食到含量相对较少的抗生素，进而对西花蓟马致死影响较小。张晓晨等(2018)研究抗生素对美棘蓟马Echinothripsamericanus(Morgan)的Wolbachia影响时也发现使用薄膜饲喂法造成的死亡率高于涂抹法，而涂抹法类似于叶片浸渍法。

本文探讨了抗生素在一定时间内对西花蓟马肠道可培养细菌的去除效果，结果表明饲喂硫酸链霉素后，西花蓟马肠道可培养细菌随浓度增加去除效果越明显。苏奇等(2012)使用利福平、氨苄青霉素和硫酸卡那霉素3种抗生素去除烟粉虱共生菌Hamiltonella时也发现浓度越高，去除效果越好。使用氨苄青霉素处理后随浓度增加可培养细菌数量减少，在浓度为25.00 mg/mL时去除效果较好，但继续升高浓度可培养细菌数量反而增多。前人在小菜蛾研究中也存在类似情况，在青霉素处理72 h后细菌数量不再下降，甚至略有回升(林晓丽, 2014)。原因可能是这些昆虫适应力非常强，随着抗生素的摄入，产生了某种适应力，也可能某些细菌已经对抗生素产生了抗性(Yulinetal., 2012; Ignasiak and Maxwell, 2017; Banseptetal., 2019)。以薄膜饲喂法饲喂氯霉素24 h后在浓度为12.50 mg/mL和25.00 mg/mL未见去除效果，将浓度增加到50.00 mg/mL时去除效果较好，张晓晨等(2018)研究利福平对美棘蓟马共生菌Wolbachia的去除作用时表明，浓度越高去除效果越好。

本研究表明，3种抗生素可明显造成西花蓟马死亡率升高和有效去除西花蓟马肠道可培养细菌，但去除西花蓟马肠道细菌后对其个体发育和种群数量的影响还需要进一步的研究，这也为后期研究西花蓟马肠道细菌的功能奠定了基础。