响应面法优化低温水提薏苡仁糖蛋白的制备及理化特性的研究*

郑文宇，林维杰，杨容，杨土娣，李静，廖兰,

（1.佛山科学技术学院 食品科学与工程学院，广东 佛山 300134；2.福州大学 生物科学与工程学院，福建 福州 350102）

薏苡仁具有抗肿瘤、提高机体免疫、抗菌、抗炎、镇痛、降血糖和调血脂等药理活性作用[1]。李时珍在《本草纲目》称其为上品养心药。薏苡仁含淀粉60%～65%、多糖5.28%、蛋白质18.31%、脂肪5.61%[2]，还含丰富的B族维生素和磷、铁、钙、锌、钾等多种矿物质。薏苡仁结构紧密，淀粉含量高，水溶性较差，生物活性物质提取率较低且易产生回生、老化和沉淀的现象，导致其难以消化，一定程度限制了其开发利用。

目前，国内外学者已就薏苡仁酯、多糖、脂类等的化学成分和功能作用进行了深入研究[3]，但对其蛋白类活性物质的研究有限，特别是其糖蛋白组分的研究缺乏。张怡等[4]通过石油醚脱脂和水提乙醇、丙酮、乙醚沉法制备糖蛋白粗品，杜晓旭[5]通过热水浸提和Sevag法制备薏苡仁糖蛋白粗品。由于缺乏高纯度样品，目前薏苡仁糖蛋白的研究局限于提升薏苡仁糖蛋白得率的手段、分离纯化方式等方面，缺乏深入薏苡仁糖蛋白高纯度活性构效关系的研究。本文以响应面法优化低温水提法的制备较高纯度的薏苡仁糖蛋白，并对其理化特性进行研究，为后续O-糖链释放前后对于薏苡仁糖蛋白活性构效关系的研究提供前期基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

薏苡仁，白壳种，购自福建南平浦城集贸市场；

三氯甲烷、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、菲咯嗪，国药集团化学试剂有限公司；

其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器

电子天平（ML204）：梅特勒-托利仪器有限公司；

高速组织匀浆机（PT 2100）：宝创科技股份有限公司；

高速冷冻离心机（TGL-20MB）：长沙湘智离心机有限公司；

高速分散均质机（FM200）：厦门精艺业主科技有限公司；

实验室pH计（EL20 ）：梅特勒-托利多仪器有限公司；

傅里叶红外光谱仪（Nicolet）：美国尼高力仪器公司 ；

酶标仪（Spark-10M）：帝肯上海贸易有限公司；

冷冻干燥机（FD-1C-50）：北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 预处理

将薏苡仁打粉过80目筛，配制成20%（质量分数）悬浮液，30 ℃恒温水化12 h。高压均质20 MPa、3次，冷冻干燥制样，密封阴凉干燥处储存备用。

1.2.2 薏苡仁糖蛋白提取精制工艺流程

薏苡仁冻干粉→水提法（控制料液比、时间、温度）→离心→过滤→蒸发浓缩→Sevag法脱除游离蛋白质→无水乙醇沉淀→溶解、透析→真空冷冻干燥→薏苡仁糖蛋白精制品（CSGP）

⑴ Sevage法脱除游离蛋白：薏苡仁糖蛋白浓缩液加入Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=3∶1[体积分数]），其中薏苡仁糖蛋白浓缩液与Sevage试剂比例为4∶1（体积分数），磁力搅拌40 min，脱除游离蛋白质，离心取上清液，重复上述操作4～5次。

⑵ 醇沉：取上清液以1∶4（体积分数）的比例加入95%乙醇，磁力搅拌35 min，密封包装置于4 ℃冰箱中放置12 h，10,000 r/min离心30 min，收集沉淀为薏苡仁糖蛋白粗品。

⑶ 透析：将薏苡仁糖蛋白粗品溶于水中，装入截留分子量为8,000～14,000 Da的透析袋内，流动的自来水透析处理48 h，收集透析袋内的液体，冷冻干燥得薏苡仁糖蛋白精制品（CSGP）。

1.2.3 薏苡仁糖蛋白含量的测定

采用王应强[6]的苯酚-硫酸法方法稍作修改，具体方法如下：

⑴ 标准葡萄糖溶液配制：准确称取10 mg的葡萄糖标准品，加水定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的标准葡萄糖溶液。

⑵ 标准曲线绘制：准备6支带塞试管，移入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL标准葡萄糖溶液。加入水补足至1.0 mL，移取1.0 mL苯酚溶液，立即移入浓硫酸5.0 mL。静置20 min，使苯酚和硫酸充分反应，振荡均匀，混合。放置于30 ℃的水浴中，恒温反应20 min。建立对照，确定490 nm处吸光度，平行测定3次，取平均值。以葡萄糖浓度和吸光度为水平坐标和垂直坐标，绘制标准曲线，建立线性回归方程。

⑷ 换算因子f的确定：根据陈双[7]的方法稍作修改，准确称量薏苡仁糖蛋白粗品10 mg，用蒸馏水定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的溶液，摇匀后静置存放。准确吸取1 mL 0.1 g/L的薏苡仁糖蛋白粗品溶液，按本章2.3.2.1的处理步骤进行操作，测出吸光值A，代入回归方程A=12.9C+0.0037，R2=0.9996中，计算出薏苡仁糖蛋白粗品中葡萄糖的浓度和理论薏苡仁糖蛋白质量M（mg），重复3次操作，测定3次结果，取平均值记为M=0.05169 mg；记实际薏苡仁糖蛋白质量m0（mg），换算因子计算结果为f=m0/M=1.93471；薏苡仁糖蛋白含量的计算公式为C=(A-0.0037)×n×f/12.9，其中A为样品的吸光值，C为样品浓度（mg/mL），n为稀释倍数，f为换算因子。

1.3 单因素实验

1.3.1 料液比对薏苡仁糖蛋白得率的影响

取6个25 mL锥形瓶，称量样品0.5 g/个，将装有配制好的样品用保鲜膜塑封瓶口防止溅出，在恒温水浴振荡器中水化提取，按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14，温度35 ℃，反应时间3 h，进行不同料液比下的单因素实验，设置3次平行实验。

1.3.2 温度对酶解产物抗氧化活性的影响

取6个25 mL锥形瓶，称取样品0.5 g/个，将装有配制好的样品用保鲜膜塑封瓶口防止溅出，在恒温水浴振荡器中水化提取，按每小时取一次样，温度35 ℃，料液比1∶10，进行不同提取时间的单因素实验，设置3次平行实验。

1.3.3 提取温度对薏苡仁糖蛋白得率的影响

取6个25 mL锥形瓶，称取样品0.5 g/个，将装有配制好的样品用保鲜膜塑封瓶口防止溅出，在恒温水浴振荡器中水化提取，按20～45 ℃每5 ℃，料液比1∶10，反应时间3 h，进行不同温度下的单因素实验，设置3次平行实验。

1.4 响应面实验设计

在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken 设计原理，以薏苡仁糖蛋白得率（Y）为响应指标，选取提取时间（A）、提取温度（B）、料液比（C）为响应因子，进行3因素3水平响应面实验设计，确定抗氧化肽制备的最佳工艺条件。实验因素水平表见表1。

表1 响应面实验因素水平编码表

1.5 薏苡仁糖蛋白（CSGP）O-糖链释放产物（DCSGP）的制备

根据Zheng等[7]人的方法稍作修改，取1.0 mg CSGP溶解于10 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液中，反应在55 ℃进行6 h，使O-糖链释放（发生β-消除反应），得到产物记为DCSGP。

1.6 薏苡仁糖蛋白O-糖链释放前后的理化性质测定

1.6.1 CSGP、DCSGP蛋白质含量和糖含量测定

根据杜晓旭等[8]人的方法稍作修改：采用凯氏定氮法和苯酚-硫酸法。

1.6.2 CSGP、DCSGP定性实验

根据李婷婷等[9]、Guo等[10]和Yun等[11]人的方法稍作修改，对颜色、状态、溶解性、双缩脲反应、280 nm处吸收、CTAB络合反应、I2-KI反应、斐林试剂反应、FeCl3反应、硫酸-咔唑反应进行测定。

1.7 统计分析

所有试验均重复3次，采用Excel 2007对实验数据计算平均值及标准差，Origin 9.0对数据进行绘图，采用SPSS（p＜0.05）比较平均值之间的差异性并进行差异性分析。

2 结果与分析

2.2 单因素实验

2.2.1 料液比的确定

由图1可以看出，随着水用量的增加，薏苡仁糖蛋白得率先上升后下降，在料液比1∶10 g/mL时达到最大。当料液比过低，水量少，溶液过饱和，薏苡仁糖蛋白溶解不充分；随着用水量的增加，薏苡仁糖蛋白溶解度逐渐上升。当料液比过大，能耗随之加大，导致实验过程中的损失加大，使薏苡仁糖蛋白提取率下降。

2.2.2 提取温度的确定

提取温度对薏苡仁糖蛋白得率的影响如图2所示。薏苡仁淀粉60 ℃会发生糊化，溶于水并与其他水溶性物质同时溶出，因此，低温提取对于提高薏苡仁糖蛋白得率是一个比较重要的因素。由图2可以看出，随着温度的升高，薏苡仁糖蛋白得率先上升后下降，在25 ℃时达到最佳。这可能是温度升高，伴随淀粉形成糊精的发生，阻碍薏苡仁糖蛋白溶出，此外过高的提取温度会导致多糖生物活性的丧失。

2.2.3 时间的确定

由图3可知，随着时间的增加，薏苡仁糖蛋白得率先上升后下降，在3 h时达到最佳。提取时间过短，薏苡仁糖蛋白提取不完全；随着提取时间的不断增加，薏苡仁糖蛋白提取率呈现下降趋势，可能是蛋白质颗粒之间作用增强，使蛋白质易凝结而聚沉，引起糖蛋白结构上的破坏和生物活性的失活。

2.3 响应面实验设计

低温水提薏苡仁糖蛋白的工艺优化根据Box-Behnken实验设计了17组实验，5组为中心点重复实验，如表2所示。本实验以糖蛋白提取率作为响应值，利用Design-Expert 8.0.6.1软件对IC50值Y进行多元回归拟合。得到二次多项式拟合方程为：

回归模型的显著性检验和方差分析见表3，由表3可知，回归方程极显著（p＜0.0001），失拟项不显著（p=0.1098＞0.05），模型拟合程度好；相关系数R2=0.9981＞0.9，说明模型满足了99%的样本空间；模型中的参数A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2都是显著的（F＜p＜0.05），显著参数超过三分之二；同时该模型的CV=1.29%，CV值低，置信度高，说明模型方程能准确地反应实验值，说明回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以通过该回归方程确定低温水提薏苡仁糖蛋白的最佳工艺条件。

表2 Box-Behnken实验设计及结果

表3 回归模型方差分析表

交互项AB、BC显著，说明提取时间和提取温度、提取温度和料液比有显著的交互作用。根据回归方程做出三维曲面图及等高线图，如图4、图5所示。固定提取时间，薏苡仁糖蛋白提取率随提取温度的增加先急剧增加后略有下降；固定提取温度，薏苡仁糖蛋白提取率随提取时间增加先增大后减小。固定提取温度，薏苡仁糖蛋白提取率随料液比的增加先急剧增加后略有下降；固定料液比，薏苡仁糖蛋白提取率随提取温度的增加先增大后减小，并且交互作用十分明显。这与前面的回归方程结果相吻合。

2.4 验证实验结果

由Design Expert结果分析可知，薏苡仁糖蛋白最佳提取方案：料液比1∶9.72，提取温度25.31 ℃、提取时间3.09 h，在此条件下，重复实验5次得薏苡仁糖蛋白提取率(6.87±0.31)%，与预测值6.91%相差不大，表明响应面模型优化具有可行性。

2.5 薏苡仁糖蛋白O-糖链释放前后的理化性质分析

由表4可以得到：CSGP和DCSGP均易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。双缩脲反应和280 nm处吸收均为阳性，说明CSGP和DCSGP均含有蛋白质。与CTAB反应呈阳性，与I2-KI反应、斐林试剂反应、FeCl3反应、硫酸-咔唑反应均呈阴性，说明CSGP为非淀粉类酸性糖蛋白，DCSGP为非淀粉类酸性糖和蛋白的混合物，均不含有还原糖、多酚、糖醛酸类物质。

表4 CSGP、DCSGP理化性质

3 结论

采用低温水提醇沉的方法制备了薏苡仁糖蛋白，通过控制料液比、提取时间、提取温度3个因素，以薏苡仁糖蛋白得率为指标进行单因素实验和响应面优化实验，得到薏苡仁糖蛋白提取率最佳体系条件为：料液比为1∶9.72 g/mL、提取时间为3.09 h、提取温度为25.31 ℃，此条件下重复实验5次得薏苡仁糖蛋白提取率为(6.87±0.31)%，薏苡仁糖蛋白是非淀粉类半结晶状的酸性糖蛋白[糖含量(42.48±1.13)%、蛋白含量(27.15±1.30)%]，不含有还原糖、多酚、糖醛酸类物质。本实验可以为进一步研究薏苡仁糖蛋白结构功能的关系和深度应用开发提供一定的理论依据。