结核感染T细胞斑点试验诊断早期骨结核的临床价值分析

缪标烈，毛兴敏，刘增辉，陈仁春

(粤北第二人民医院骨外科，广东 韶关 512028)

骨结核感染及发病十分隐匿，给临床诊断带来极大的困难，目前能够简便、快速诊断结核病的方法却十分有限，很多患者因为没有得到早期治疗而致残、致畸[1]。回顾文献显示[2]，TuliⅠ期骨关节结核在治疗后关节功能得到完全恢复或部分受损，TuliⅡ期骨关节结核接受治疗关节功能可保留50%～70%，因此寻求一种能够早期、快速运用于骨结核诊断的方法成为当务之急。目前国内大部分医院主要是应用结核菌素纯蛋白衍生物试验(pure protein derivative，PPD试验)、抗结核抗体(tuberculosis antibody，TB-ab)及病原学检查等传统检测辅助诊断骨结核，临床应用过程发现PPD皮试及TB-ab的灵敏度、特异度及阳性预测值均较低，病原学检查虽然有高特异度，但等待结果时间太长，灵敏度也较低[3-4]。近年来有学者将核酸扩增检测法(Xpert MTB/RIF)用于辅助诊断结核病，获得较高的灵敏度和特异度。竺祖军等[5]通过手术或穿刺获得含菌的病灶组织或脓液，应用于Xpert MTB/RIF检测诊断骨结核病，灵敏度达到82.0%，特异度为96.67%，与董伟杰等[6]研究结果基本一致，获得较好的临床效果。但刘佳庆等[7]却发现，在结核菌涂阴的患者中Xpert MTB/RIF检测的灵敏度仅为56.5%，认为Xpert MTB/RIF检测要获得满意的临床效果要求检测标本含菌量达到其检测限值。而早期骨结核大部分为结核菌涂阴患者，且大多无需手术，获得充足含菌量的标本有较大难度，使用Xpert MTB/RIF检测出现假阴性概率大，阳性率低。近年国外有学者将结核感染T细胞斑点试验(T cell spot test of tuberculosis infection，TSPOT.TB)应用于肺结核的诊断，获得较高的灵敏度和特异度。TSPOT.TB检测标本为外周血，并且支气管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液等多种标本同样具有检测价值，取材简便且具有多样化，无需带菌标本，实验过程相对简单，大大提高了阳性率，临床应用价值大，易推广。目前国内也有文献报道将TSPOT.TB应用于肺结核的诊断，获得满意的临床效果，但将其应用于诊断早期骨结核的报道少见，把该检测与传统诊断骨结核的方法做比较的研究更少见，暂无明确数据表明其诊断早期骨结核的临床应用价值。本研究将80例疑似早期骨结核病例作为研究对象，通过TSPOT.TB检测并与传统诊断方法进行对比分析，探讨其辅助诊断早期骨结核的临床应用价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集粤北第二人民医院2017年7月至2018年12月收治的疑似TuliⅠ期及Ⅱ期骨结核病例80例行前瞻性研究，其中男43例，女37例；年龄10～75岁，平均年龄(45.25±7.62)岁。所有病例均行PPD皮试、TB-ab检测、结核菌病原学检查及TSPOT.TB检测。通过病灶穿刺获得组织，行病理检查(金标准)确诊后获得52例骨结核病例归类为A组，非骨结核病28例归类为B组。本研究过程符合赫尔辛基宣言标准，所有研究对象均自愿签署临床研究知情同意书。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：(1)疑似Tuli分期Ⅰ期及Ⅱ期骨结核患者；(2)无免疫缺陷疾病；(3)同意参加本次研究并配合完善相关检查。排除标准：(1)有明确的免疫缺陷疾病；(2)有严重的终末期疾病患者；(3)近期有大量使用激素的患者。

1.3 方法 所有病例行PPD皮试、TB-ab检测、结核菌病原学检查及TSPOT.TB检测。将病理检查作为骨结核诊断金标准，骨结核病例归类为A组，非骨结核病归类为B组，观察两组病例的PPD皮试、TB-ab检测、病原学检查及TSPOT.TB的灵敏度、特异度及阳性预测值。

1.3.1 TB-ab检测 本研究采用酶联免疫吸附试验(ELSIA法)取血清按试剂盒(上海奥普公司)说明进行TB-ab检测。结果判断：样本的吸光值/临界对照品的吸光度值的比值>6为阳性，比值<6为阴性。

1.3.2 PPD皮试 将PPD 0.1 mL原液在前臂掌侧前1/3行皮内注射并标记皮丘位置。72 h后观察皮丘，无硬结或硬结<5 mm为(-)，不发红且硬结直径≥5 mm提示(+)。

1.3.3 TSPOT.TB检测 TSPOT.TB检测是采用γ-干扰素释放原理，结合酶联免疫斑点技术，对机体结核杆菌感染进行检测的方法。其设有阴性参照孔、早期抗原靶6(early stage antigen targe-6，ESAT-6)和培养滤液蛋白10(ulture filtrate protein-10，CFP-10)作为刺激源的两个实验孔及以植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)作为刺激源的阳性参照孔(见图1)。实验方法：用含肝素锂的试管采集外周静脉血4～5 mL，进行单个核细胞分离、洗涤及计数并配制细胞悬液，对标本进行体外抗原刺激与孵育，洗板显色后进行斑点阅读和计数。达到以下标准判定为阳性：(1)当阴性参照孔斑点数<5个，任意一个实验孔斑点数减去阴性参照孔斑点数需≥6个。(2)当阴性参照孔斑点数≥6个，任意一个实验孔斑点数必须是阴性参照孔斑点数的2倍以上。

图1 TSPOT.TB检测示意图

1.3.4 结核菌病原学检查[8]局麻下对病灶进行穿刺，获得病变组织，按检验要求行改良罗氏结核杆菌培养及标本直接涂片；结核菌培养有结核菌生长并经显微镜下镜检证实视为阳性(见图2～3)；涂片结果按萋-尼氏抗酸染色法进行判读，镜下找到结核菌视为阳性(见图4)。本研究将结核菌涂片及结核菌培养两种检查统一归类为结核菌病原学检查。病理检查作为诊断新标准(见图5)。

图2 结核菌培养阳性

图4 结核菌抗酸染色涂片阳性(萋-尼氏染色法，×100油镜)

1.4 观察指标 记录两组患者TSPOT.TB检测、PPD皮试、TB-ab检测、结核菌病原学检查的阳性及阴性病例数，计算以上检测在早期骨结核诊断中的灵敏度、特异性及阳性预测值，进行对比分析。

1.5 统计方法 应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数资料以%表示，比较采用χ2检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。使用ROC曲线分析PPD皮试、TB-ab、结核菌病原学检查及TSPOT.TB在早期骨结核诊断中的应用价值。

2 结 果

PPD皮试、TB-ab、TSPOT.TB及病原学检查在骨结核诊断中的结果(见表1～2，见图6)，提示TSPOT.TB在早期骨结核诊断中有较高灵敏度、特异性和阳性预测值，TSPOT.TB诊断早期骨结核的灵敏度显著高于PPD皮试、TB-ab和结核菌病原学检查(χ2值分别为7.385，29.352，35.455，P<0.05)，差异有统计学意义。TSPOT.TB诊断骨结核的特异度显著高于PPD皮试、TB-ab(χ2值分别为14.275和9.524，P=0.015)，差异有统计学意义。TSPOT.TB诊断骨结核的阳性预测值显著高于PPD皮试、TB-ab(χ2值分别为11.778和19.665，P=0.035)，差异有统计学意义。TSPOT.TB诊断骨结核特异度及阳性预测值稍低于结核菌病原学检查(χ2值分别为2.074和0.660，P值分别为0.150和0.417)，差异无统计学意义。

表2 PPD皮试、TB-ab、TSPOT.TB及病原学检查预测值(%)

图6 四种检测之间灵敏度、特异度、阳性预测值对比图

绘制PPD皮试、TB-ab、TSPOT.TB及病原学检查在骨结核诊断中的ROC曲线图(见图7)。其中TSPOT.TB检测ROC曲线下面积为0.902，PPD皮试的ROC曲线下面积为0.796，TB-ab检测ROC曲线下面积为0.725，病原学检查ROC曲线下面积为0.587，TSPOT.TB诊断骨结核的ROC曲线下面积最大，诊断价值最高。

图7 四种检查方法诊断骨结核ROC曲线图

3 讨 论

目前对于早期骨结核诊断方面临床仍无良好的诊断方法，特别是在贫困地区基层医院，诊断方法单一、诊断方法复杂，无简单、快速、可靠的辅助诊断和筛查方法，导致大部分骨结核患者在早期没有得到及时治疗而致残、致畸，给患者身体上带来巨大痛苦。

PPD皮试、TB-ab及病原学检查等传统辅助诊断结核的方法应用于临床已有几十年的历史，但在临床结核诊断上的总体表现欠佳，并未达到预期的诊断效果[9]。TSPOT.TB是检测结核杆菌抗原刺激下外周血或全血的单核细胞释放γ干扰素的水平，对诊断结核感染有重要临床价值[10-11]。国外已经将TSPOT.TB应用于肺结核诊断当中，并取得了良好应用效果，但国内应用TSPOT.TB进行早期骨结核诊断的研究报道很少，其应用价值尚有待于进一步研究证实[12]。本研究通过将TSPOT.TB检测与多种传统诊断早期骨结核的方法进行对比，研究结果显示TSPOT.TB在诊断TuliⅠ期及Ⅱ期骨结核感染有较高的敏感度、特异度和阳性预测值，ROC曲线下面积达到0.902，诊断价值明显优于传统诊断方法，差异有统计学意义，提示以TSPOT.TB诊断骨结核有助于提升诊出率。Broderick等[13]国外学者曾以31例肺外结核患者为例，对TSPOT.TB诊断肺外结核的价值展开前瞻性研究，研究结果显示TSPOT.TB诊断肺外结核的灵敏度达到100%。李晓等[14-15]研究结果显示TSPOT.TB诊断骨结核的敏感性为96%，且灵敏度不受人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染影响。梁大华等[16-18]国内学者在研究中报道TSPOT.TB 在结核诊断中的敏感性达到94.21% 、特异性达到94.50%、阳性预测值达到74.20%[19-20]。上述研究结果均与本次研究结果相近，充分证实本次研究结果可靠。

Zhou Zibo等[21]对TSPOT.TB和Xpert MTB/RIF在骨结核中的诊断价值进行了比较分析；TSPOT.TB的灵敏度(89.7%)显著高于Xpert MTB/RIF检测(74.4%，P<0.05)；Xpert MTB/RIF分析的特异性(97.1%)高于T-SPOT.TB(82.4%，P<0.05)。虽然两种检测灵敏度和特异度各有优势，但Xpert MTB/RIF和TSPOT.TB的ROC曲线下面积分别为0.857和0.860，差异无统计学意义，表明TSPOT.TB和Xpert MTB/RIF在骨结核诊断中具有同等价值。Xpert MTB/RIF检测获得较高的特异度要求标本含菌并达到其检测限值，早期骨结核要获得含菌量高的标本较难；而TSPOT.TB检测标本范围广泛，不仅局限于血液标本，对支气管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液等多种标本同样具有检测价值，能够应用多种标本对结核病做出诊断[22]。TSPOT.TB检测标本多样提升了骨结核诊断准确性，也决定了TSPOT.TB检测具有简便、快捷等优势。本次研究中未涉及非血液标本检测。

尽管TSPOT.TB试验诊断骨结核具有优势，但也存在不足，TSPOT.TB检测所需试剂盒价格昂贵，对检测操作技术的要求也很高，必须配备相关实验设备，导致此技术全面推广难度大，无法在基层医院推广应用。优化TSPOT.TB检测技术，推行医联体合作以减少医疗成本和检测费用，是促进TSPOT.TB检测技术推广应用的有效策略。

综上所述，TSPOT.TB检测诊断早期骨结核具有较高敏感度、特异度，且具有检测安全、快速、可靠等优势，值得临床推广应用，但检测成本高使其应用受到限制。相信随着相关技术的不断发展、新医改的推行，TSPOT.TB检测成本将不断降低，有望实现TSPOT.TB检测的推广应用。