贵州青钱柳膜结合转录因子CpMTF9的基因克隆及功能鉴定

安银 戴星 罗海霞 熊孟连

【摘   要】 ：NAC转录因子作为植物最大的转录因子家族之一，当植物遭到逆境时，会通过一系列应激反应将调控信号逐级放大，促进 NAC转录因子与启动子结合调控相关基因的表达，以增强细胞脅迫应答能力。

【关键词】 青钱柳;CpMTF9;基因克隆;生物信息学分析

中图分类号：[Q37]               文献识别码：A               文章编号：2096-1073（2020）11-0054-55

[Abstract] NAC transcription factors， as one of the largest transcription factor families in plants， amplify the regulatory signals step by step through a series of stress responses， and promote the expression of related genes by binding NAC transcription factors to promoters to enhance the ability of cell stress response.

[Key words]  Qingqianliu; CpMTF9; gene cloning; bioinformatics analysis

当植物遭到非生物胁迫之后，内质网内会累积大量错误折叠的蛋白质，从而影响植物的生长发育[1]。为了缓解恶劣环境对植物生长发育的影响，细胞会通过启动信号转导途径调节相关基因的表达，去帮助错误的蛋白质折叠[2]。NAC家族是目前发现最大的特异性转录因子基因家族之一[3]。拟南芥NAC083，具有脱氧核糖核酸和蛋白结合活性[4]，可编码一个NAC域转录因子。青钱柳（Cyclocarya Paliurus）是我国的濒危树种之一[5]。国内现阶段对于青钱柳的研讨重点主要是药用价值、青钱柳苗木的快速繁殖技术等方面，关于NAC基因抗逆方面的报道很少。

本研究通过青钱柳转录组文库的随机克隆测序分析，获得与NAC家族膜结合转录因子基因AtNAC083相似的一条cDNA序列（Cluster-29186.100002）。经预测分析，该基因为膜结合转录因子。对青钱柳CpMTF9进行生物信息学分析，分析结果有助于加深对青钱柳内质网胁迫途径的认识。

1  结果与分析

1.1  CpMTF9基因的克隆及其编码蛋白质与Motif搜索

用植物总RNA提取试剂盒提取青钱柳叶片的总RNA，再用反转录试剂盒对青钱柳的cDNA进行合成;以青钱柳叶片cDNA为模板，设计引物对CpMTF9进行克隆，通过测序显示成功得到含有一个完整开放阅读框的长度为723bp的cDNA序列，共编码形成240个氨基酸。利用在线工具ExPASy对CpMTF9的氨基酸序列展开理化属性分析，结果表明该基因序列所翻译蛋白质的分子量为26.86kD，等电点为9.65，蛋白质分子式为C1182H1824N340O355S12;在组成蛋白的20种氨基酸中，该蛋白半衰期为30h，CpMTF9蛋白的不稳定指数为41.04，所以该蛋白为不稳定蛋白。利用PROSITE在线工具对蛋白进行Motif搜索，结果显示该蛋白的Motif与其结构域分析结果一致，表明该蛋白具有NAC家族成员相关的序列模式（图1）。

1.2   CpMTF9结构分析

通过在线工具ExPASy对CpMTF9进行三级结构预测，预测结果表明，CpMTF9蛋白与拟南芥ANAC083蛋白的空间三级结构相似（图2）。

2  结果与讨论

生物信息分析技术目前已经成为预测目的基因功能的基本方法，但由于只能通过预测来判断基因的功能，因此要确定目的基因的功能就必须要对目的基因进行验证。研究表明非生物胁迫会引发错误折叠的蛋白质富集在内质网中，导致青钱柳减产。为了满足市场对青钱柳的需求，本研究成功从青钱柳中克隆得到一个NAC转录因子CpMTF9，该基因是NAC家族成员中膜结合转录因子相关基因。同源多序列比对显示，CpMTF9基因与拟南芥ANAC083基因的序列、功能都具有很高的相似性。因此，推测CpMTF9基因在缓解恶劣环境对植物生长发育的影响方面有着重要的作用。这对于未来研究CpMTF9基因在青钱柳内质网胁迫信号途径中的作用具有重要意义。

3  实验方法

使用反转录试剂盒，依次加入RNA，Oligo-dT，dNTP，DTT，M-MLV反转录酶和ddH2O后将RNA反转录成cDNA。再以cDNA为模板，使用PFU-KOD高保真酶进行目的基因的PCR扩增。将得到的CpMTF9目的片段及PGBKT-7载体同时用BamH Ⅰ及ECOR I在37℃下进行双酶切。酶切回收的产物用连接酶进行16℃过夜酶连。将过夜连接的产物全部转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并涂布于Kan+抗性培养基上、倒置在37℃培养箱过夜培养。挑单克隆进行阳性鉴定后提取质粒，并送到公司进行测序。

参考文献：

[1] Liu J. X.， Howell S.H .， Endoplasmic Reticulum Protein QualityControl and Its Relationship to Environmental Stress Responsesin Plants，The Plant Cell， 2010， 22（9）：2930-2942.

[2] Shinozaki K.， Yamaguchi S. K .， Seki M.， Regulatory network ofgene expression in the drought and cold stress responses，CurrentOpinion in Plant Biology ， 2003，6（5）：410-417.

[3] Olsen A.N.，Ernst H. A.，Leggio L.L.， Skriver K. DNA-bindingspecificity and molecular functions of NAC transcription factors，Plant Science （Oxford）， 2005， 169（4）：0-797.

[4] Suyal G.，Rana V.S.，Mukherjee S. K.，Wajid S.， Choudhury N. R.，Arabidopsis thaliana NAC083 protein interacts with mungbeanyellow mosaic india virus （mymiv） rep protein，Virus Genes， 2014， 48（3）：486-493.

[5] 邹荣灿，吴少锦.青钱柳的分布、化学成分及药理作用研究进展[J].中国药房， 2017，28（31）：4449-4451.

（编辑：赫亮）