四君子汤对人小肠上皮细胞辐射损伤的保护作用

王成芳，邵 帅，曲功霖，齐雪松，苟 巧

(中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所，辐射防护与核应急中国疾病预防控制中心重点实验室，北京 100088)

腹盆腔恶性肿瘤的种类很多，主要有消化系统肿瘤如肝癌、胃癌和直肠癌；妇科肿瘤如宫颈癌、卵巢癌和子宫内膜癌等。发病率逐年升高，胃癌、结直肠癌和肝癌更是除肺癌以外的我国发病率和死亡率较高的常见肿瘤。为防止病灶转移复发，通常要进行放射治疗。放射性肠损伤，是腹盆腔恶性肿瘤放射治疗引起的常见并发症，小肠上皮细胞对放射线高度敏感，射线能够使小肠绒毛缩短，上皮细胞脱落，炎症细胞浸润，最终导致肠黏膜功能被破坏，从而出现呕吐、腹泻、细菌感染等症状，严重影响患者的生活质量[1]。目前，针对放射性肠道损伤仍旧缺少防治药物。中草药及其天然成分不仅具有药源广泛、毒性小等特点，而且可以通过多种途径、多靶点治疗疾病，其中许多具有免疫调节、抗氧化和清除自由基等作用[2-4]。中药注重整体调理，且有与化学合成药物相互补充的作用，可用于癌症的放疗过程中的辐射防护。

本课题组已有研究显示，四君子汤对淋巴母细胞AHH-1及BALB/c小鼠的电离辐射损伤具有较好的防护作用[5-7]。为进一步探讨其在肠道辐射损伤中的作用，本文以人小肠上皮细胞HIEC-6为受试对象，研究四君子汤水提物对其辐射损伤的影响，旨在为临床应用四君子汤治疗急性放射病及肿瘤放疗过程中肠道损伤的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料与主要试剂

Thermo CO2恒温培养箱、Multiskan GO型连续波长酶标仪，购自美国Thermo公司；FACS Calibur流式细胞仪，购自美国BD公司；Axiocam ERC5S型倒置显微镜，购自德国ZEISS公司；5810R型离心机，购自德国Eppendorf 公司；TP-214型分析天平，购自丹佛仪器(北京)有限公司；Milli-Q A10型纯水仪，购自美国Millipore公司；电泳仪、化学发光检测系统，购自美国Bio-Rad 公司；Image J 公共图像处理软件(美国国立卫生研究院)。四君子汤水提取物(黄色粉末)为本所毒理室提取喷雾干燥所得，用时用细胞培养液(含5%胎牛血清的Opti-MEM)溶解配制。胎牛血清和细胞培养基(美国Gibco公司)；CCK-8 试剂盒(日本同仁化学研究所)；Annexin V-PE/7AAD细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物有限公司)；细胞周期检测试剂盒(美国Thermo 公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔和山羊抗小鼠抗体(北京中杉金桥公司)；兔抗人γH2AX(美国Cell Signaling Technology 公司)；小鼠抗人Bcl-2、β-tublin 抗体(美国Abcam 公司)；总蛋白提取、蛋白定量及ECL 发光检测试剂盒(北京普利莱公司)；标准蛋白Marker(美国Thermo 公司)。

1.2 药物配制

称取四君子汤水提物粉末(四君子汤粉末提取率为35.5%)，加培养液溶解，配制成1.90 mg/mL药液，实验中倍比稀释，现用现配。

1.3 照射条件

北京师范大学化学学院钴源60Co γ射线照射，源强5 000 Ci，照射距离为79 cm，剂量率为1.0 Gy/min。

1.4 细胞培养

人小肠上皮细胞HIEC-6购自上海纪宁实业有限公司。用含4%胎牛血清的Opti-MEM培养液于37 ℃、5%CO2条件下培养。每3天换1次培养基，每周传代1次。

1.5 CCK-8检测细胞存活率

取对数生长期的HIEC-6细胞接种于96孔板，5×103个/孔，每组设6个复孔，接种后24小时经不同剂量(0、2、4、6、8、10 Gy)的60Co γ射线照射或照射前1小时用含不同浓度(1.90、0.95、0.48、0.24、0.12、0.06 mg/mL)四君子汤水提物的培养基作用细胞，给予4.0 Gy γ射线照射(设立对照组和空白对照组)。照射后继续培养24、48、72、96 h，按照CCK-8试剂盒说明书操作。全波长酶标仪测定各孔450 nm波长下吸光度(OD)，计算细胞存活率。细胞存活率=(OD处理组-OD培养液对照组)/(OD空白对照组-OD培养液对照组)×100%。

1.6 细胞凋亡与周期检测

取对数生长期的HIEC-6细胞接种于6 孔板中，每组设3个复孔，培养24 h后，照射前1 h分别经0.95、0.24和0.06 mg/mL药物作用，设立空白对照组和照射对照组，给予4.0 Gy的照射剂量后继续培养3 d，按照细胞凋亡和细胞周期试剂盒说明书操作。经流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率和死亡率；细胞周期检测结果经ModFit LT(Verity Software House, Topsham, ME, USA)软件分析。

1.7 γH2AX、Bcl-2蛋白的表达

细胞接种和实验分组同细胞周期检测，照射3 d后收获细胞。提取细胞总蛋白30 μg 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及转膜。一抗采用兔抗人γH2AX和小鼠抗人Bcl-2抗体(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜；二抗采用HRP 标记山羊抗兔抗体(1∶3 000 稀释)常温孵育1 h。用小鼠抗人β-tublin 抗体(1∶2 000稀释)再进行杂交作为内参照。经化学发光液孵育，Bio-Rad ChemiDoc XRS+ 化学发光成像系统显影拍照(Bcl-2 蛋白分子量为26 kDa，γH2AX 蛋白分子量为17 kDa，β-tublin蛋白分子量为55 kDa)。

1.8 统计学方法

所有计量资料均采用均值±标准差表示，采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计分析。所有数据均进行方差齐性检验：方差齐，多组数据比较采用单因素方差分析，两组数据比较采用q检验；方差不齐，采用秩和检验。p<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIEC-6细胞对γ射线的敏感性

CCK-8 试剂盒检测不同剂量(0、2、4、6、8、10 Gy)γ射线照射后HIEC-6细胞在24～96 h的存活率，结果示于图1。由图1可见，照射后的24～72 h，细胞的存活率与照射剂量、受照时间的依赖关系并不明显，即细胞的存活率不是逐渐降低的，这可能与辐射诱导细胞周期调控、凋亡以及修复程度不同有关。而在照射后96 h，随着照射剂量的增加，细胞的存活率则显著降低。因此，在后面药物辐射损伤保护作用实验中，选择4.0 Gy的照射剂量。

图1 人小肠上皮细胞HIEC-6不同剂量照射后24～96 h的细胞存活率

2.2 四君子汤对60Co γ射线照射后HIEC-6细胞增殖的影响

图2为四君子汤对不同剂量60Co γ射线照射后人小肠上皮细胞HIEC-6增殖的影响。由图2可见，4.0 Gy γ射线照射后96 h的人小肠上皮细胞HIEC-6存活率为55%，而照射前经四君子汤水提物处理后，细胞存活率明显升高(p<0.01)，说明药物对细胞具有显著的保护作用，且与药物浓度呈正相关，即随着浓度升高，细胞存活率显著增加，在0.95 mg/mL时，细胞的存活率达到84%，较之照射对照组增加了29%，而升高药物浓度2倍后(1.90 mg/mL)，细胞存活率并无明显变化。因此，后续实验的药物浓度最高使用0.95 mg/mL。

*与空白对照组比较差异非常显著，p<0.01；△与照射对照组比较差异显著，p<0.05；△△与照射对照组比较差异非常显著，p<0.01。

2.3 四君子汤对60Co γ射线照射后HIEC-6细胞凋亡的影响

表1和图3为四君子汤对4.0 Gy60Co γ射线照射后人小肠上皮细胞HIEC-6凋亡的影响。由表1和图3可见，人小肠上皮细胞HIEC-6经4.0 Gy照射后72 h，细胞凋亡率12.14%，死亡率2.21%，显著高于空白对照组(p<0.05)。照射前1 h给予不同浓度四君子汤水提物(0.95、0.24、0.06 mg/mL)处理后，细胞凋亡率和死亡率显著降低(p<0.01)。表明药物干预使细胞凋亡减少并具有保护作用。

图3 流式细胞术检测不同处理组的HIEC-6细胞凋亡图

表1 四君子汤对照射后HIEC-6细胞的凋亡率和死亡率的影响(n=3)

2.4 四君子汤对60Co γ射线照射后HIEC-6细胞周期的影响

表2为四君子汤对4.0 Gy60Co γ射线照射后人小肠上皮细胞HIEC-6细胞周期的影响。由表2可见，HIEC-6细胞照射后72 h，细胞周期在S、G2/M期均有阻滞，与空白对照组相比，G1期的细胞比例显著降低，S、G2/M期比例升高。照射前给予四君子汤水提物0.95 mg/mL处理后，与照射组相比，S期细胞比例显著降低(p<0.01)，G1期的细胞比例显著增加(p<0.05)，表明药物干预后，细胞周期S期阻滞得到缓解。

表2 四君子汤对照射后HIEC-6 细胞周期分布比例的影响(%)(n=3)

2.5 四君子汤对HIEC-6细胞照射后Bcl-2和γH2AX蛋白表达的影响

图4为四君子汤对4.0 Gy60Co γ射线照射后人小肠上皮细胞Bcl-2和γH2AX蛋白表达的影响。图4的蛋白免疫印迹结果显示，同空白对照组(C)相比，照射对照组(IR)Bcl-2蛋白表达明显降低，而γH2AX蛋白表达明显升高，经0.95 mg/mL的四君子汤水提物处理后(0.95+IR)，减缓了这一变化，Bcl-2蛋白表达升高，γH2AX蛋白表达降低，提示四君子汤水提物可能通过调控Bcl-2和γH2AX的表达来减缓人小肠上皮细胞HIEC-6的辐射损伤。

图4 HIEC-6细胞的Bcl-2和γH2AX蛋白表达情况

3 讨论

辐射引起的细胞损伤常常表现为细胞增殖受到抑制，细胞周期进程产生变化，细胞发生凋亡和坏死等等。肠黏膜上皮是机体更新活跃的组织之一，对射线高度敏感[8]。本文首先通过CCK-8法检测不同照射剂量下的人小肠上皮细胞HIEC-6在24～96 h的增殖情况，结果表明，细胞在照射后96 h增殖受到显著抑制，而经过药物预处理后照射(4.0 Gy)，细胞增殖抑制情况得到缓解，凋亡和坏死大大降低，且细胞的存活率随着药物浓度的升高而增加，促进HIEC-6的增殖。

肠细胞凋亡是肠黏膜屏障受损的主要原因[9-10]。本研究通过Annexin V-PE/7AAD双染标记法检测对于受照后HIEC-6细胞凋亡及坏死，结果显示，在4.0 Gy的照射条件下细胞表现为明显的凋亡和坏死比例升高。通过预先给药，四君子汤水提物显示出对HIEC-6细胞的保护作用，较为明显地降低了细胞损伤程度，并且这种作用可能持续至照后72 h。此外，射线可使凋亡抑制基因Bcl-2的蛋白表达降低或Bcl-2蛋白稳定性下降，使凋亡的发生率明显增加。细胞在受到电离辐射后，DNA发生双链断裂损伤(double strands breaks，DSBs)，组蛋白H2AX快速发生磷酸化(即γH2AX)，一旦γH2AX介导的DNA损伤修复完成后，γH2AX会被Pph3等脱磷酸化，形成H2AX在其他DNA损伤修复中被重新利用，从而使γH2AX在损伤位点被有效的去除。本文检测了照射后72 h细胞的γH2AX蛋白表达，发现其仍有表达，而经过四君子汤作用后的细胞γH2AX表达有所下降，其可能通过某种细胞内外信号转导途径，使辐照后HIEC-6细胞Bcl-2基因的蛋白表达量增加，增强细胞DNA损伤修复能力，激活存在的DNA修复酶，促进DNA复制，抑制细胞发生凋亡，从而起到保护小肠上皮细胞的作用。细胞周期检测结果显示，照射后的细胞S、G2/M期比例升高，表明辐射诱导的DNA损伤阻碍了基因组的复制进程[11]，四君子汤则降低了细胞S期、提高了G1期的比例，促进细胞的修复，起到保护作用。

四君子汤作为我国传统的中药补益剂，临床常用于治疗慢性胃炎、消化性溃疡等属脾胃气虚者。中医认为脾胃为后天之本，与机体免疫能力息息相关，因而四君子汤在临床上也用于肿瘤患者放化疗后的辅助用药，目的是提高患者的免疫能力抵抗放化疗的毒副作用[12-13]。本文的研究结果表明，四君子汤在人小肠上皮细胞辐射损伤中具有修复作用，其作用机制与调控细胞周期进程、减少细胞凋亡、促进DNA损伤修复相关，为腹盆腔肿瘤放疗过程中肠道损伤的防治提供了实验依据。