碱热法辅助提取圆红冬孢酵母油脂

李 强， 黄其田， 赵宗保

（1.中国科学院大连化学物理研究所 生物技术部， 辽宁 大连 116023； 2.中国科学院大学， 北京 100049）

0 引言

日益严峻的能源危机和能源安全形势， 促使国家大力发展可再生能源。 生物柴油是最重要的液体可再生能源之一， 不仅在能源性质方面可取代化石柴油，还具有安全环保等优良特性[1]。 常规的生物柴油生产原料有植物油脂、 动物油脂和餐饮业废油等， 然而以它们为原料会产生“与人争粮，与人争地”的问题，致使生物柴油的发展受到限制。微生物油脂具有和动植物油脂相似的组成，而且微生物油脂的生产周期短且不受气候和环境的限制，因此，微生物油脂是生产生物柴油的潜在原料[2]。

传统的微生物油脂生产过程包括微生物油脂发酵、菌体收集、菌体干燥和胞内油脂提取。 常用的油脂提取方法为酸热法， 该方法以干菌体为原料，利用酸对细胞进行裂解，具有细胞破碎充分、油脂提取彻底的优点， 被认为是最有效的油脂提取方法[3]。 但是，酸热法以干菌体为原料，干燥步骤使得该方法工艺繁琐且能耗巨大， 增加了油脂提取成本，限制了该方法的推广[4]。 进一步简化微生物油脂生产工艺、降低油脂提取能耗，是推广微生物油脂的必要条件。

近年来，为了简化微生物油脂提取工艺，降低油脂提取能耗， 有研究者提出了采用湿菌泥直接进行油脂提取的方法，并受到广泛关注[4]。 为了从湿菌体中有效地提取油脂， 采取合理有效的方法进行细胞破碎是关键。 常用的细胞破壁方法主要包括物理法、生物法和化学法。物理法主要包括微波辅助法、超声波辅助法和玻璃珠破碎法，其中，微波辅助法是通过微波加热使细胞壁出现破碎，以便于油脂萃取，但该方法的能耗极高；超声波辅助法是通过超声波加速细胞壁破碎， 但该方法不易放大，且能耗高；玻璃珠破碎法是通过玻璃珠撞击来破碎细胞，能耗虽低，但不易于放大且油脂提取率通常低于40%，因此不能得到广泛应用[5]～[7]。生物法主要是通过细胞裂解酶裂解细胞， 也有通过溶藻菌对细胞进行裂解，反应条件温和，且易于放大，但裂解酶具有高度的底物选择性，而且价格昂贵，不利于生产成本的控制[8]，[9]。 化学法主要包括酸热法。 陈宏选考察了浓硫酸辅助提取微生物油脂的方法，并建立了动力学模型[10]。

产油酵母是生产微生物油脂的优良候选菌株，特别是圆红冬孢酵母，它可以利用玉米秸秆水解液积累超过细胞干重60%的油脂[11]。 本文选用圆红冬孢酵母作为生产微生物油脂的模式菌株，期望建立以湿菌体为原料， 以碱热法辅助细胞破壁的提取微生物油脂的有效方法。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

圆红冬孢酵母 （Rhodosporidium toruloides CGMCC 2.1389）购于中国通用微生物培养物保藏中心（CGMCC）。

1.2 培养基

YEPD 液体培养基：葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨10 g/L、琼脂10 g/L，pH 值为6.0。

YEPD 固体培养基：葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨10 g/L、琼脂10 g/L、琼脂粉15 g/L，pH值为6.0。

批式油脂发酵培养基：葡萄糖70 g/L，酵母粉0.5 g/L，（NH4）2SO42 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L。

1.3 培养方法

1.3.1 种子液的制备

将新鲜斜面活化好的圆红冬孢酵母接种于装有50 mL YEPD 液体培养基的250 mL 三角瓶中，并置于30 ℃，200 r/min 的摇床中培养24 h。

1.3.2 圆红冬孢酵母批式油脂发酵

在3 L 的发酵罐中进行圆红冬孢酵母批式油脂发酵，初始装液量为2 L，接种量为10%，温度为30 ℃，pH 值为5.6，通气比（每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值）为0.8，溶氧为40%～50%[2]，[3]。 在批式发酵过程中，通过流加1 mol/L 的NaOH和1 mol/L 的HCl 自动控制发酵液的pH 值。

1.4 油脂提取方法

1.4.1 酸热法

每克干菌体加入4 mol/L 的HCl 6 mL，于78℃消化1 h；取出冷却，加入等体积的氯仿和甲醇，充分混合萃取1 h；取氯仿层，向剩余物中加入等体积氯仿再萃取一次，取氯仿层；合并氯仿层，用等体积0.1%的NaCl 溶液洗涤； 取氯仿层用无水硫酸钠干燥，并用氯仿洗涤3 次；真空蒸发除去氯仿，剩余油烘干称重。

在本研究中分析油脂提取率时，假定此方法的油脂提取率为100%。

1.4.2 碱热法

圆红冬孢酵母油脂发酵完成后，离心收集湿菌体 （含水量为90.9%）； 按比例添加不同量的NaOH（如比例为0.15，即每克干菌体添加0.15 g的NaOH）， 于不同温度水浴中处理不同时间，用HCl 调pH 至中性； 用等体积的有机试剂萃取2次，旋转蒸发除去溶剂，获得油脂，烘干称重。

1.5 分析方法

1.5.1 脂肪酸组成分析

微生物油脂甲酯化： 称取70.0 mg 的待测油脂，加入5%的KOH/CH3OH 溶液0.5 mL，加热回流50 min；然后加入BF3的甲醇溶液（BF3乙醚溶液和CH3OH 的体积比为4∶10）0.7 mL， 继续回流10 min；冷却后加入1 mL 去离子水和0.7 mL 正己烷，混匀后吸出有机相，经去离子水洗涤两遍后用于气相色谱分析。

气相色谱条件：FFAP 石英毛细管柱（30 mm×0.25 mm×0.25 μm），进样器温度为250 ℃，进样量为0.5 μL；N2流速为41 mL/min，检测器（FID）温度为280 ℃；H2和空气流速分别为33，100 mL/min；柱温为190 ℃；分流进样。脂肪酸甲酯通过对照标准样品定性，采用面积归一法确定相对含量。

1.5.2 中性脂组成分析

在高效薄层色谱分析仪（HPTLC，DESAGA，德国）上进行中性脂组成分析。油脂样品在硅胶板上点样完毕后，用展开剂（正己烷、无水乙醚和冰乙酸的体积比为80∶40∶1）展开至前沿硅胶板3 cm处， 之后用吹风机吹干硅胶板， 将染色液（H3PO4和CuSO4·5H2O 的质量体积分数分别为8%和10%）均匀喷洒在硅胶板上，然后于160 ℃加热4 min 后取出，用540 nm 处可见光进行扫描。

1.5.3 环境扫描电镜分析

将碱热处理（NaOH 的添加比例为0.15，于78℃处理3 h）后的样品和未经处理的样品分别稀释200 倍 （OD600=0.68）， 用环境扫描电镜（Quanta650FEG，赛默飞世尔，美国）进行拍照。

2 结果与分析

2.1 碱热法辅助提取油脂单因素优化

圆红冬孢酵母生产的油脂是胞内产物， 被细胞壁和细胞膜所包裹， 须破壁后用有机溶剂进行提取。 传统的油脂提取过程包括发酵液收集、沉降、干燥、破壁和萃取。 本研究直接以湿菌泥为原料， 用NaOH 热辅助破壁， 再用有机溶剂进行萃取。为获得更高的油脂提取率，须考察NaOH 添加比例、处理时间和温度对油脂提取率的影响。

2.1.1NaOH 添加比例对油脂提取率的影响

圆红冬孢酵母发酵完毕后， 首先在湿菌体中加入一定比例的NaOH，然后78 ℃水浴处理1 h，再用等体积的氯仿和甲醇萃取两次， 旋转蒸发除去溶剂， 获得油脂。 在每克干菌体中分别添加0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，1.0 g 的NaOH 时， 即NaOH的添加比例分别为0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，1 时，圆红冬孢酵母油脂提取率的变化如图1 所示。从图1可以看出： 当NaOH 的添加比例分别为0.2，0.4，0.6 时， 油脂提取率分别为24.3%，41.7%，47.0%；继续增大NaOH 的添加比例至1.0 时， 油脂提取率仍为47.0%。 这说明在不改变其他油脂提取条件的情况下，当NaOH 的添加比例为0.6 时，细胞破壁比较充分，油脂提取率相对较高。

图1 NaOH 的添加比例对油脂提取率的影响Fig.1 Effect of addition ratio of NaOH on lipid extraction yields

2.1.2 碱热处理时间对油脂提取率的影响

当NaOH 的添加比例为0.15， 碱热处理时间分别为1，2，3，4，5，6 h 时， 圆红冬孢酵母油脂提取率的变化情况如图2 所示。从图2 可以看出：随着碱热处理时间的增加，油脂提取率逐渐增加，即细胞壁裂解程度逐渐增加；当碱热处理时间由1 h增加到2 h 时， 油脂提取率从37.9%增加到了70.7%；当碱热处理时间增加到3 h 时，油脂提取率升高至84.1%；之后继续增加碱热处理时间，油脂提取率增加缓慢， 当碱热处理时间增加到5 h时，油脂提取率为90.9%。

图2 碱热处理时间对油脂提取率的影响Fig.2 Effect of alkali-heat treatment time on lipid extraction yields

2.1.3 碱热处理温度对油脂提取率的影响

碱热处理温度同样影响碱热处理效果， 温度过低，无法到达破壁效果，温度过高，容易使碱进入细胞与甘油三酯发生皂化反应， 从而降低油脂提取率。 因此， 我们考察了当NaOH 添加比例为0.15，碱热处理时间为3 h 时，碱热处理温度对油脂提取率的影响（图3）。 从图3 可以看出：当碱热处理温度为68 ℃时， 油脂提取率仅为11.1%，这说明在此温度下，NaOH 对细胞壁的破坏程度较低；当碱热处理温度从78 ℃升高到88 ℃时，油脂提取率由87.1%下降到了62.1%。 这可能是由于部分细胞完全裂解， 油脂从细胞中释放出来，与NaOH 发生了皂化反应。

图3 碱热处理温度对油脂提取率的影响Fig.3 Effect of alkali-heat treatment temperature on lipid extraction yields

2.2 油脂提取溶剂及条件的优化

根据相似相容原理， 最佳的萃取溶剂既要有强大的油脂萃取能力，又要有较好的极性。 因此，我们考察了萃取溶剂以及萃取时间和温度对油脂提取率的影响，结果如图4 所示。

图4 萃取条件对油脂提取率的影响Fig.4 Effect of extraction conditions on lipid extraction yields

从图4 可以看出， 萃取溶剂的选择对油脂提取率的影响很大， 而萃取时间和温度对油脂提取率的影响很小。与前期酶处理的结果类似，正己烷和石油醚的油脂提取率均较低，低于50%[12]。从图4（b）可以看出：当萃取时间不小于1 h 时，油脂提取率不再随着萃取时间的增加而增加； 当萃取温度升高至40 ℃，油脂提取率也不再随着萃取时间的增加而增加。根据相似相容的原理，萃取溶剂的疏水性越强，对中性脂的溶解能力就越强，萃取的油脂量就越大。 碱热法提取油脂是在高水分体系中进行的， 大量的水在细胞周围形成了一层极性“膜”，严重阻碍了疏水性溶剂向细胞内的渗透，因此，选择合适极性的油脂有利于提高油脂提取率。乙酸乙酯、 二氯甲烷和氯仿的相对极性分别为0.259，0.309 和0.228， 对油脂的萃取率分 别为88.2%，81.0%和85.5%，即乙酸乙酯的油脂提取率最高。 此外，乙酸乙酯具有毒性小、可生物降解和对环境更加友好等特点， 是一种较为理想的油脂萃取溶剂。

2.3 单因素优化碱热辅助提取油脂条件

进行单因素优化后， 将碱热处理时间延长至3 h，选择处理温度为78 ℃，选择更加环保的乙酸乙酯进行萃取，此时，NaOH 的添加比例对油脂提取率的影响如图5 所示。 从图5 可以看出，当NaOH 的添加比例为0.2 时， 油脂提取率为99.3%，比之前的24.3%（图1）提高了3 倍。

图5 NaOH 的添加比例对油脂提取率的影响Fig.5 Effect of addition ratio of NaOH on lipid extraction yields

2.4 碱热处理对圆红冬孢酵母细胞形态的影响

为了更详细地了解碱热法用于微生物油脂回收的原理， 使用环境扫描电镜观察了碱热法处理前后圆红冬孢酵母细胞形态的变化（图6）。从图6可以看出：不经任何处理时，圆红冬孢酵母细胞呈椭球形， 细胞表面光滑且紧密； 使用碱热法处理后，细胞壁变得粗糙且生有倒刺，但细胞并没有塌陷或者裂解。这说明碱热处理虽然没有裂解细胞，但是使细胞表面变得粗糙， 部分细胞壁多糖发生断裂，细胞壁出现空洞，促进了乙酸乙酯进入细胞与油脂结合， 从而提高了油脂提取率。 碱热处理后，细胞结构保持完整，没有明显的细胞碎片，表明碱热处理并不会裂解细胞， 只是会对细胞的表面结构产生一定影响， 胞内油脂在碱热处理过程中并未释放出来， 可推测碱热处理对油脂组成的影响较小。

2.5 油脂组成分析

油脂提取方法（油脂提取条件均为加入等体积的乙酸乙酯，于30 ℃萃取30 min）对油脂中性脂组成的影响如表1 所示。

由表1 可知， 通过碱热法和酸热法所提取得到的油脂中均具有游离脂肪酸（FFA）、单酰基甘油 （MAG）、 二酰基甘油 （DAG） 和甘油三酸酯（TAG）。 圆红冬孢酵母油脂的主要成分是TAG，相对含量大于70%， 其中酸热法获得的油脂中TAG 的相对含量较碱热法略高；酸热法和碱热法提取得到的FFA 和MAG 的相对含量相差较小；碱热法得到的油脂中DAG 的相对含量为24.5%，略高于酸热法的15.9%。总之，碱热法处理得到油脂的中性脂组成和含量与酸热法相对一致。

油脂提取方法对油脂脂肪酸组成的影响如图7 所示。从图7 可以看出，碱热法和酸热法获得油脂的脂肪酸主要由肉豆蔻酸 （C14:0）、 棕榈酸（C16:0）、棕榈油酸（C16:1）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）和亚油酸（C18:2）组成，这与文献[13]的结论相一致。 两种方法得到油脂的脂肪酸组成相同，表明碱热法得到的油脂可用于生物柴油生产。

图7 油脂提取方法对油脂脂肪酸组成的影响Fig.7 Effect of lipid extraction methods on composition of fatty acid

3 结论

本文建立了以碱热法辅助破壁， 直接利用湿菌泥进行微生物油脂提取的方法， 并通过单因素条件优化， 获得了最佳的碱热法油脂萃取条件为湿菌泥中NaOH 的添加量为0.2 g/g，之后经78 ℃水浴处理3 h 并用乙酸乙酯萃取， 油脂提取率可达99.3%。通过环境扫描电镜分析可知，碱热处理使细胞壁产生较多孔洞，但细胞壁并未完全裂解，油脂并未释放到处理液中。 这些孔洞将提高有机溶剂对油脂的萃取效率， 同时又有利于保护油脂的原始组成。 由GC 和HPTLC 分析可知，碱热法提取得到的油脂，与酸热法无显著差异。 因此，碱热法是一种以湿菌体为原料直接进行油脂提取的新方法，该方法省却了菌体干燥的步骤，不仅可以简化微生物油脂提取工艺， 还可以降低微生物油脂提取的能耗， 为微生物油脂技术的工业化应用打下坚实基础。