姜半夏配方颗粒与饮片煎剂对小鼠AML12肝细胞毒性的比较研究*

韩月丹 毛培江 业 康 金 捷 黄晶晶 栾会玲 金祖汉 王志安

1 杭州市第一人民医院 浙江 杭州 310006

2 浙江省中药研究所有限公司 浙江 杭州 310023

本研究以有毒药材姜半夏为例，小鼠AML12肝细胞为研究载体，比较同批次药材来源的姜半夏配方颗粒与其传统饮片煎剂相同生药浓度下的毒性差异，为配方颗粒有效性、安全性、质量标准等研究提供实验研究依据，为配方颗粒的临床安全用药提供参考。

1 材料

1.1 实验样品：姜半夏配方颗粒（批号：K1704059）：称取姜半夏配方颗粒2g（每克配方颗粒相当于12g生药），研钵内加蒸馏水研磨成细粉后，加纯水稀释定容至100ml，得浓度为0.24g生药/ml药液（240g生药/L），临用时用完全培养基稀释成浓度为48g生药/L的母液。姜半夏饮片煎剂（批号：17042106)：称取240g中药饮片放于煎药罐中，煎煮两次，合并滤液，55℃恒温烘干后粉碎，得69.8g干粉，相当于3.44g生药/g干粉。称取6.98g干粉，纯水稀释定容至100ml，得浓度为0.24g生药/ml药液（240g生药/L），临用时用完全培养基稀释成浓度为48g生药/L的母液。样品均由浙江景岳堂药业有限公司提供。

1.2 试剂 ：DMEM/F12（1∶1)培 养液（GIBCO，批号8118043）；胎牛血清（四季青，批号20170315）；胰蛋白酶-EDTA（GENVIEW，批号 711160101100）；双抗（GEN‐VIEW，批号84020101100）；四甲基偶氮唑蓝（Amresco）；二甲基亚砜（Amresco，批号1077C109）；Hoechst33258荧光染液（碧云天，批号032318180417）；抗荧光猝灭封片液（碧云天，批号030218180319）。

1.3 实验仪器设备：精密天平（BS110S，北京赛多利斯天平公司）；酶联免疫检测仪（M200，TECAN）；二氧化碳孵育温箱（NU 5810E，NUAIRE）；超净台（SW-CJ-IF，苏州净化设备有限公司）；荧光显微镜（DM 4000，Leica）；光学显微镜（XSZ-D2，重庆光学仪器厂）。

1.4 细胞：小鼠肝实质细胞株AML12，购于中国科学院细胞库。

2 方法

2.1 细胞培养：AML12肝细胞用含10% FBS，1%青-链霉素的DMEM/F12（1∶1)完全培养液（含1ml ITS Liquid Media Supplement/100ml、40ng地塞米松/100ml）培养，置37℃，5% CO2的培养箱中，饱和湿度下进行常规培养。观察其培养液的颜色变化与细胞生长情况，及时换液，细胞长至对数生长期时用于实验。

2.2 MTT法检测细胞活力：每块96孔板设6个空白孔，给药组分别加入不同浓度（母液组以及1/2、1/4、1/20、1/100、1/500、1/2500、1/12500母液浓度组）的姜半夏配方颗粒与饮片煎剂药液，每组设6个复孔，每孔200μl，暴露48h后，用多功能酶标仪检测490nm处各孔A值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（A给药组-A空白）/（A对照组-A空白）×100%。

2.3 Hoechst33258染色法检测细胞核形态：以每毫升5×104个细胞接种至六孔板，每孔2ml，分别加入1/20和1/100母液浓度（母液浓度为48g生药/L）的姜半夏中药配方颗粒与其饮片煎剂，设不加药物的对照组，暴露48h后，每孔加入0.5ml 4%多聚甲醛固定后弃去固定液，每孔加入0.5ml Hoechst33258染液，染色5min，滴一滴抗荧光猝灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，在激发波长360nm处用显微镜观察并拍照，进行细胞核形态观察，并使用Image J软件进行荧光强度半定量分析。

3 结果

3.1 姜半夏配方颗粒与其饮片煎剂对AML12肝细胞活力的影响：姜半夏配方颗粒与其饮片煎剂作用AML12肝细胞48h后，配方颗粒母液组以及1/2、1/4、1/20、1/100、1/500、1/2500、1/12500母液浓度组的细胞存活率分别为（140.47±10.45）%、（130.58±13.34）%、（119.72± 12.36）%、（104.71± 6.55）%、（104.43±5.75）% 、（101.60 ± 6.65）% 、（103.21 ± 9.93）% 、（100.32±6.38）%；饮片煎剂母液组以及1/2、1/4、1/20、1/100、1/500、1/2500、1/12500母液浓度组细胞存 活 率 为（145.23± 14.86）%、（126.79±4.87）%、（112.88±3.97）%、（91.79±3.09）%、（91.09±6.74）%、（94.95±5.25）%、（94.62±4.93）%、（93.28±4.11）%（结果见图1）。结果表明，暴露48h后，姜半夏配方颗粒（1/20-1）浓度组和姜半夏饮片煎剂（1/20-1）浓度组随着浓度的增加，增强了细胞的活力，但浓度为1/20与1/100时两组间具有极显著性差异，其中饮片煎剂组出现了细胞抑制的情况。

图1 48h不同浓度姜半夏配方颗粒与饮片煎剂对AML12细胞存活率的影响（n=6)

3.2 姜半夏配方颗粒与其饮片煎剂对AML12肝细胞形态结构的影响：根据MTT的实验结果，选择1/20和1/100母液浓度（母液浓度为48g生药/L）的姜半夏配方颗粒与其饮片煎剂进行荧光染色对比实验。姜半夏配方颗粒组与其饮片煎剂组作用于AML12肝细胞48h后，均出现不同程度细胞核固缩、胞质浓缩、部分破裂等凋亡现象，其荧光强度逐渐增强；相同剂量下比较，姜半夏配方颗粒组细胞核固缩凋亡情况较饮片煎剂组少（结果见图2）。荧光半定量结果同样显示在药品母液浓度的1/20与1/100时，姜半夏配方颗粒组细胞凋亡的较其饮片煎剂组少（结果见图3）。结果表明，姜半夏配方颗粒与其饮片煎剂组均对AML12肝细胞有一定的损伤；在相同浓度下，姜半夏配方颗粒对细胞的损伤较其饮片煎剂小。

4 讨论

图2 荧光显微镜观察姜半夏配方颗粒与饮片煎剂处理AML12细胞48 h后Hoechst33258染色细胞核形态（标尺：100μm）

图3 荧光强度半定量分析结果

目前，中药配方颗粒在美国、日本等国家发展极快，除满足本国外还大量出口。我国对中医药产业也开始重视和大力推动，把中药配方颗粒纳入国家中医药方面发展的重要内容之一。对于中药配方颗粒与其饮片煎剂特别是有些毒性药材、复方等的有效性、安全性是否一致，学术界尚一直存有争论。

本实验在细胞水平，对有毒中药姜半夏配方颗粒与其传统煎剂的毒性进行了初步的研究。有研究发现，生姜与生半夏同用可以显著减少生半夏对小鼠腹腔的刺激性。而在药物细胞毒性的早期研究过程中，通过体外肝细胞作为通用的肝毒性体外试验工具，常对药物的早期安全性进行评价。根据细胞活力实验结果表明，药物浓度为母液浓度1/20与1/100时，两组间具有极显著性差异，其中姜半夏饮片煎剂组出现了细胞抑制情况。荧光实验中，AML12肝细胞在姜半夏配方颗粒与其饮片煎剂作用48h后，与对照组比较均出现不同程度细胞核固缩，其荧光强度逐渐增强。荧光半定量结果显示在相同剂量下，姜半夏饮片煎剂使荧光更强，证明其细胞核固缩更显著，细胞凋亡更明显，因此说明姜半夏配方颗粒对小鼠AML12肝细胞毒性小于姜半夏饮片煎剂。具体原因有待后续结合成分分析等更深入的研究来验证。

本研究探索性地使用细胞毒性评价的方法对比姜半夏饮片煎剂与其所制成中药配方颗粒的毒性差异，实验结果表明，在相同生药浓度下，中药配方颗粒毒性小于其饮片煎剂。