脐血干细胞移植对帕金森大鼠行为和炎症因子的影响

樊志刚 王东 高丽 师瑞红河南医学高等专科学校

帕金森病是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其病理特征为中脑黑质多巴胺（DA）能神经元的大量缺失和死亡[1]，药物治疗虽有疗效，但对震颤麻痹效果不好。细胞治疗成为了一个新的方向，主要是将各种分化好的多巴胺能神经原注射入纹状体，脐血又称胎盘血或脐带血，含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞[2]，但干细胞分化为多巴胺能神经元发比例一直不高，体内存活时间较短，与其所处局部周围的细胞环境有一定的关系，研究发现植入的细胞与宿主损伤处的细胞相互作用可导致细胞因子的表达变化，这些细胞因子或炎症介质在功能恢复方面起着重要作用。

本次实验将在体外培养的脐血间充质干细胞(Humanumbilical cord blood -derived mesenchymal stem cell HUMSCs)定向注射到帕金森大鼠脑内，观察移植后对帕金森大鼠旋转行为、TNF-α、IL-4的影响，为进一步明确干细胞的治疗机制和提高移植效果提供更多选择。

一、材料与方法

1.实验动物。随机对照动物实验，雄性SD大鼠，220—250 g用于PD造模，实验中对动物的处置符合动物伦理学要求。

2.主要试剂和仪器。6-羟基多巴胺、阿朴吗啡，脐血干细胞提纯分离试剂，ELISA试剂盒，倒置显微镜Olympus BX41。

3.PD模型的建立。用38g/L水合氯醛(380mg/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠后，然后固定于立体定位仪上，参照《大鼠脑立体定位图谱》，确定大鼠右侧MFB和VTA两点坐标。向每点用微量进样器注射新鲜配置的6-OHDA溶液5μL。7天后腹腔注射阿朴吗啡(1.2mg/kg)以诱发旋转实验，随机将30只造模成功大鼠分成实验组与对照组，每组15只。

4.干细胞的分离和培养：(1)选择健康产妇的产后脐带血液（800～160ml）。(2) 脐带血在30min内利用脐血干细胞提纯分离试剂进行分离，将分离的细胞以2×107/mL接种于20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养。取第3代的细胞用于后续实验。

5.脐血干细胞移植。第3代干细胞调整浓度为3.0×105μL-1，进行细胞移植。以前囟为零点，定位右侧纹状体2个移植点：前囟前1.2 mm，矢状缝右2.5mm，颅骨下5.2 mm；前囟前1.5 mm，矢状缝右2.5mm，颅骨下7.3mm。实验组每点注射8μLHUMSCs，对照组按上述方法和坐标，注入8μL的PBS。

6.观察指标。

（1）行为学检测。细胞移植后3,5,7周，每组每只大鼠腹腔注射1.2mg/kg的阿扑吗啡，进行旋转测试，注射后20min开始计数，并计数3min。

（2） ELISA法检测脑内TNF-α、IL-4水平。细胞移植后3,5,7周，每组各取大鼠4只，以戊巴比妥钠麻醉后取脑，参照周靖[3]等实验方法使BCA蛋白定量试剂盒进行组织蛋白定量，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，检测TNF-α及IL-4的水平。

7.统计学分析采用所有数据用SPSS13.0软件处理，计量资料以均数±标准差表示，а=0.05。

二、结果

1.干细胞培养。倒置显微镜下可见，早期细胞不大且呈扁圆形，10d以后逐渐变大呈现杆状(图1)，20d(第3代)后向两级伸出凸起为长梭形(图2)。

图1 脐血干细胞形态（×100）

图2 脐血干细胞形态（×100）

2.脐血干细胞移植对大鼠行为学的影响。与对照组比较，移植后3周实验组出现旋转行为下降，但差异无统计学意义（P>0.05）。移植后5周和7周，实验组旋转次数均出现明显减少，功能行为得到好转，差异均有统计学意义（P<0.05）。与移植前比较，移植后5周和7周，旋转次数减少较多，差异有统计学意义（P < 0.05），见下表。

移植HUMSCs前后各组帕金森病大鼠旋转次数(r/min)

3.脐血干细胞移植对大鼠脑内TNF-α水平的影响。与对照组比较，实验组移植后3周，TNF-α水平下降不明显(P>0.05)；实验组移植后5周和7周，TNF-α水平明显降低(P< 0.05)；与移植前比较，实验组移植后5周和7周，TNF-α水平均明显下降（P< 0.05）。见下表

干细胞移植前后各组TNF-α水平的比较（ng/L）

4.脐血干细胞移植对大鼠脑内IL-4的影响。与对照组比较，实验组移植后3周， IL-4水平升高不明显(P>0.05); 实验组移植后5周和7周， IL-4水平明显升高(P< 0.05);与移植前比较，实验组移植后5周和7周，IL-4水平也显著升高（P< 0.05）。见下表

干细胞移植前后各组IL-4水平的比较（ng/L）

三、讨论

目前间充质干细胞和胚胎干细胞常用于基础实验治疗PD，但胚胎干细胞取材不易，而间充质干细胞不仅取材方便，同时增值和分化能力又比较强。是干细胞治疗的首选细胞。脐血间充质干细胞可诱导分化为神经细胞和间质支持细胞，并分泌BDNF、GDNF等多种神经营养因子[4]。实验证实，猴子脑内移植脐血间充质干细胞后，发现其逐步向黑质内迁移并存活，且动物的运动症状明显改善，协调和平衡能力也逐渐好转[5]。本研究结果也显示，实验组在移植后5、7周大鼠旋转次数较移植前均显著下降，表明hUMSCs移植有利于PD大鼠运动功能的改善。

研究发现，细胞因子构成的炎症免疫细胞外液环境与MSCs移植效果有一定的关联，细胞移植后与宿主细胞发生相互影响，正性或负性调节特定细胞因子水平，进一步影响移植细胞的存活、迁移和分化[6]。TNF-α为常见促炎性因子，它可以抑制中枢神经的功能修复。IL-4为抗炎因子，可促进神经纤维再生。本实验结果显示，移植后6周和9周，实验组大鼠脑内TNF-α较对照组明显减低,说明hUMSCs移植后可显著抑制肿瘤坏死因子a的水平，减少炎症反应对对功能恢复的不利影响。相对于对照组，hUMSCs移植后6周和9周，实验组大鼠脑内IL-4水平均明显升高，说明hUMSCs移植后, IL-4的升高促进神经纤维再生，使大鼠旋转行为有了明显的改善。

有研究表明间充质干细胞是促进内源性神经干细胞的分化；抑制神经细胞凋亡；促进血管再生，重建突触等方式发挥作用的[7]。帕金森氏病主要是多巴胺能神经元受损，会在以后的实验中检测神经递质多巴胺的含量，用免疫组化证实多巴胺能神经元的恢复等。