NGR 修饰唑来膦酸长循环脂质体制备及其表征研究

叶雪丹 顾露囡 王 增

第三代双膦酸盐类药物唑来膦酸（zoledronic acid，ZOL）临床上主要用于治疗肿瘤相关高钙血症及恶性肿瘤骨转移引起的骨痛。ZOL 血浆半衰期仅为15min，体内的药代动力学特征影响ZOL 在肿瘤组织的分布，无法作用到肿瘤细胞，不利于临床抗肿瘤治疗[1]。近年研究发现，ZOL 能通过调节肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macro-phages，TAMs）数量和活性，抑制肿瘤新生血管的生成，肿瘤细胞的侵袭、浸润等作用，从而发挥抗肿瘤作用[2]。本课题组拟利用APN/CD13 在肿瘤新生血管内皮细胞表面高表达的特性，合成APN/CD13 的配体天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸（Asn-Gly-Arg，NGR），将NGR 修饰在脂质体表面，构建具有肿瘤血管靶向功能的NGR 修饰ZOL 长循环脂质体（NGR-PEG-ZOL-LPs），并对其进行表征，为进一步研究体内外抗肿瘤作用奠定基础[3]。

1 材料与方法

1.1 仪 器 高效液相色谱仪（日本岛津公司，型号LC-20AD），激光粒径分析仪（英国Malvern 公司，型号Nano-ZS），透射电子显微镜（日本Jeol 公司，型号JEM-1200EX），冷冻干燥机（美国LABCONCO 公司，型号Labconco FreeZone）。

1.2 试 剂 大豆卵磷脂（德国Ludwigshafen 公司，批号04010025119），胆固醇（美国Avanti Polar Lipids公司，批号Lot X0515），mPEG2000-DSPE（上海芃硕生物科技有限公司，批号Lot L003），Asn-Gly-Arg，NGR 多肽和NGR-mPEG2000-DSPE 由江苏强耀生物科技有限公司合成（批号Lot L003），ZOL 原料药（江苏正大天晴医药股份有限公司，纯度>99%，批号20180605），ZOL 标准品（中国食品药品检定研究院，批号100778-201003），其他试剂均为分析纯。

1.3 NGR-PEG-ZOL-LPs 制备 在圆底烧瓶中加入磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000、NGR-DSPE-PEG 2000（质量比为20:7:5:6:0.4），加入6mL 氯仿/甲醇（4：2v/v）。使用旋转蒸发器在40℃减压下除去溶剂，形成一层薄的脂膜。用预热的6mg/mL ZOL pH7.6 缓冲盐溶液水合，手动震摇。脂质体悬浮液在60℃下放置水浴磁力搅拌30min，每15min 取出震摇，快速3次冷冻解冻（-80℃～37℃）。使用14000Da MWCO 透析袋针透析24h 去除游离ZOL。分级过滤后加入58mM 乳糖作为冻干支持剂，再过0.22μm 滤膜，放入-20℃冰箱内预冻48h，抽真空干燥。

1.4 表征研究 取NGR-PEG-ZOL-LPs 样品（稀释20 倍）置于样品池中，用Malvern ZS90 粒径电位仪测定脂质体的粒径分布和电位，重复三次。取NGRPEG-ZOL-LPs 样品（稀释20 倍），用透射电镜观察其表面形态，采用悬滴法制备样品，将纳米粒水溶液滴加到铜网的支撑膜上，用滤纸小心吸干表面水分后，醋酸双氧铀染色，并用滤纸吸取多余的水，晾干，透射电镜观察其结构。

1.5 包封率和载药量检测

1.5.1 ZOL 色谱条件建立 色谱柱：ZORBAX SBC18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈：水相（焦磷酸钠缓冲液，称取焦磷酸钠1.7804g，溶于500mL水，加3mL 10%四丁基氢氧化铵，用50%磷酸调节pH 至4.00）=4：96。流速：0.8mL/min；柱温：30℃；紫外检测波长：215nm；进样量：20μL。

1.5.2 标准溶液配制 精密称取1.07mg ZOL，用pH7.6 缓冲液制备成1070μg/mL 的储备液。流动相稀释储备液并制备含ZOL 为66.88、33.44、16.72、8.36、4.18、2.09μg/mL 的标准溶液，进样20μL，记录峰面积，并绘制标准曲线。

1.5.3 包封率和载药量测定 制备得到的ZOL 脂质体装入透析袋内，透析24h，每隔4h 更换1 次pH7.6缓冲液。取100μL 透析后的样品，加入300μL 甲醇超声破坏，再加入600μL 流动相，9000rpm，离心5min，取上清液进HPLC。计算公式：EE%（W0-W1）/W0×100%。DL%＝（W0-W1）/Wt×100%（EE%：包封率；DL%：载药量；W0：ZOL 投药量；W1：未包裹进脂质体中的药物量；Wt：脂质材料与脂质体中ZOL 的质量之和）。

2 结果

2.1 ZOL 色谱条件 NGR-PEG-ZOL-LPs 溶液中ZOL 的主峰与ZOL 标准品溶液主峰的保留时间一致，说明脂质体辅料对ZOL 的检测无影响，方法专属性良好。同时，根据色谱方法学研究得到的回归方程为Y=18631X-1494.6，r2=1，表 明ZOL 在2.09～66.88μg/mL 内，具有良好的线性关系（见插页图1）。

图1 ZOL 色谱图

图2 NGR-PEG-ZOL-LPs 透射电镜图（醋酸双氧铀染色×50000）

2.2 表征研究结果 透射电镜下显示NGR-PEGZOL-LPs 呈类圆形，大小分布均匀，无明显聚集（见插 页 图2）。NGR-PEG-ZOL-LPs 的 平 均 粒 径 为（271.43±9.23）nm，Zeta 电位为-（36.20±0.20）mv，多分散系数（PDI）为（0.15±0.03），理化性质相对稳定。

2.3 包封率和载药量测定 根据公式计算，NGRPEG-ZOL-LPs 包封率为8.41%，载药量为2.12%。

3 讨论

靶向递药系统已成为肿瘤治疗的有效策略。氨肽酶N（APN/CD13）是在肿瘤新生血管内皮细胞表面高度表达的跨膜蛋白，NGR 是由Asn-Gly-Arg 组成的三肽小分子，对在肿瘤新生血管内皮细胞表面高表达的APN/CD13 具有高度亲和力，可以作为肿瘤血管靶向修饰物[4]。本研究将NGR 的氨基端与mPEG 2000-DSPE 的羧基端通过氨酰脱水缩合反应形成NGR-mPEG2000-DSPE，亲水端的NGR 多肽暴露在脂质体外层，有利于其寻找肿瘤血管特异性靶点[5]。实验结果显示，NGR-PEG-ZOL-LPs 的Zeta 电位为-（36.20±0.20）mv，相关研究表明，当Zeta 电位的绝对值>20 时，脂质体相对稳定，同时本研究组将脂质体冻干粉重新用PBS 分散后测到的多分散系数（PDI）为（0.15±0.03），说明脂质体分散性较好，不易出现聚集，有利于冻干粉临床使用[6]。

同时，研究结果发现，NGR-PEG-ZOL-LPs 包封率为8.41%，可能主要有以下原因造成：（1）脂质体的包封率与粒径大小密切相关，粒径越大，包封率也会越大；（2）与药物的性质有关，ZOL 水溶性较高，容易从脂质体表面存在小孔泄漏出来，导致包封率的下降。因此，我们将在下一步研究中提高ZOL 的包封率。

本研究以肿瘤微环境中数量最多的炎症细胞群TAMs 作为靶点，是肿瘤治疗的潜在靶点。TAMs 大量存在于肿瘤血管周围、无血管区和低氧区，其中M2型TAMs（M2-TAMs）则在肿瘤的侵袭、转移、免疫抑制、新生血管形成等方面发挥了不可忽视的重要作用，不仅是侵入实体肿瘤中单核细胞群的主要组成细胞，也是炎症进展成癌症的主要桥梁[7-8]。临床样本检测表明，M2-TAMs 在乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肺癌等上皮来源的肿瘤组织中大量存在，是引起这些肿瘤耐药、转移、侵袭的重要因素[9]。由此可见，抑制M2-TAMs 的功能，减少其数量，是提高抗肿瘤效果的有效手段。

本实验制备的NGR-PEG-ZOL-LPs 理化性质稳定，本课题组将通过体内实验进一步探讨NGRPEG-ZOL-LPs 对M2-TAMs 抑制作用。