北沙参不同部位提取物镇咳祛痰作用研究＊

何军伟，朱继孝，杨 丽，张寿文，程 访，曾金祥，钟国跃＊＊

（1. 江西中医药大学 中药资源与民族药研究中心 南昌 330004；2. 江西中医药大学 现代中药制剂教育部重点实验室 南昌 330004）

伞形科珊瑚菜属珊瑚菜（Glehnia littoralisFr.Schmidt ex Miq.）为多年生草本植物，生长于海边沙滩或栽培于肥沃疏松的沙质土壤，主产于内蒙古赤峰、山东莱阳及河北安国。北沙参为该植物的干燥根，又称莱阳参，夏、秋二季采挖，直接洗净阴干或除去须根后沸水烫制，去皮或不去皮[1-3]。北沙参为传统常用的大宗中药材，其味甘、微苦，性微寒，养阴清肺、益胃生津，主要用于肺热燥咳等[1]。该药材也在蒙医药学中广泛使用，药用历史悠久，其蒙文音译汉文名为“查干-扫日劳”，具有清肺、止咳等功效，主要用于治疗肺热咳嗽等疾病[4]，可知镇咳和祛痰是北沙参最主要的功效之一。临床上，含有北沙参药材的中成药较多，如扫日劳清肺止咳胶囊、北沙参四味汤、七味沙参汤散、八味檀香散，其中扫日劳清肺止咳胶囊为重要的蒙药复方，近年来每年的销售额超过一亿元。

据报道[5-19]，北沙参提取物或萃取部位具有多种生物活性，包括免疫调节、镇咳、祛痰、细胞毒性、酶抑制活性等药理作用。此外，屠鹏飞等[8]采用小鼠模型评价了多种中药沙参（包括北沙参）类的镇咳、祛痰作用，结果表明北沙参乙醇提取物具有较强的镇咳作用，但其祛痰作用较弱。另外，北沙参提取物及其各萃取部位镇咳、祛痰作用的谱-效关系尚无报道。因此，亟需对北沙参乙醇总提物及其各萃取部位进行深入的镇咳、祛痰活性研究，尤其进行北沙参的高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱与镇咳、祛痰活性的关联性研究。北沙参具有丰富的化学结构类型，包括：苯丙素类、单萜类、简单酚酸类、聚炔类、挥发油类等，具有抗炎、细胞毒性、抗菌、抗氧化、镇痛等药理作用[15,20-29]。然而，北沙参镇咳、祛痰的化学成分、生物活性及作用机制仍不清楚。本课题组前期从北沙参乙醇提取物中报道了16 个化学成分，包括3 个生物碱类（(3S)-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid(1)、(1S,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-卡巴林-3-羧基(2)、(1R,3S)-1-甲基-1,2,3,4-四氢-β-卡巴林-3-羧基(3)）、4 个 苯 丙 素 类（(S)-phenyllactic acid (4)、(S)-phenyllactic acid methyl ester (5)、 scopoletin(6)、isopimpinellin(7)）、4 个 简 单 酚 酸 类（catechol(8)、salicylic acid(9)、 4-hydroxyphenethyl alcohol (10)、vanillic acid 1-O-[β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside]ester(11)）、1 个 邻 苯 二 甲 酸 酯 类（dibutyl phthalate(12)）、3 个 聚 炔 类（falcarinol(13)、falcarindiol(14)、(8E)-1,8-heptadecadiene-4,6-diyne-3,10-diol(15)）和1 个脂肪酸类化合物（9-hydroxystearic acid (16)[30]。此外，还对上述分离得到的所有化合物进行详细的化学分类、以及在进化过程中的亲缘性进行了推测和系统的分析。

北沙参为常用中药材，自1963 年版《中国药典》始，历版《中国药典》均有收载。2015年版《中国药典》仅对北沙参药材的【来源】、【性状】和【显微鉴别】（横切面组织特征）项进行了描述；《香港中药材标准》（2010 年版，第三册）规定有【来源】、【性状】、【鉴别】（横切面组织特征，粉末特征，法卡林醇对照的薄层鉴别，指纹图谱）、【检查】、【浸出物】、【含量测定】项。因此，北沙参药材的质量标准极不完善，且其有效成分尚不清楚，亟需对该药材镇咳、祛痰的化学成分、药理作用、及其关联性进行系统地研究。

采用谱-效学关联性研究对解决中药及民族药的物质基础，建立药材的质量标准体系具有十分重要的意义[31]。本研究采用灌胃小鼠北沙参总提取物（BSS总）、石油醚萃取部位（BSS-A）、乙酸乙酯萃取部位（BSS-B）、正丁醇萃取部位（BSS-C）和水部位（BSSD），考察北沙参总提取物及其不同极性溶剂萃取部位的镇咳、祛痰作用，并初步探讨了提取物HPLC 指纹图谱与镇咳、祛痰作用的关联性，为阐明该药材的药效物质基础提供科学依据，也为建立科学、简便的质量控制体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF 级别的昆明小鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司），体质量在18-22 g 之间，雌雄各半，许可证号：SCXK（湘）2013-0004。

1.1.2 试剂与材料

咳必清（批号：130304，上海全宇生物科技内乡制药有限公司）；氯化铵（批号130517）、浓氨水（批号131011）、碳酸氢钠（批号120219）（西陇化工股份有限公司）。

本实验中所用北沙参药材来自内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司，经鉴定为伞形科珊瑚菜属珊瑚菜（G.littoralis）的干燥根。

1.1.3 主要仪器

旋转蒸发仪（BUCHI，步琦公司，瑞士）、高效液相色谱仪（SHIMADZU，岛津公司，日本）、超声波清洗器（KQ3200DE，昆山市超声仪器有限公司，中国）、紫外可见分光光度计（UV-1800，岛津公司，日本）。

1.2 实验方法

1.2.1 北沙参提取物制备

干燥的北沙参药材（10.0 kg）、粉碎，依次用80%（100 L）、40%（100 L）的乙醇常温渗滤提取，合并提取液，减压蒸除乙醇，得深褐色总浸膏（BSS 总，2.14 kg）。然后，将BSS总溶于一定量的水中，分别用不同极性溶剂等体积萃取5次，减压蒸除溶剂，依次得到石油醚萃取部位（BSS-A，58.0 g）、乙酸乙酯萃取部位（BSS-B，22.5 g）、正丁醇萃取部位（BSS-C，121.1 g）和水部位（BSS-D，1 799 g）。以上提取物用一定量的水溶解，配置成低剂量为1.0 g·kg-（1按生药量计算）和高剂量为2.0 g·kg-1混悬液，备用。

1.2.2 镇咳实验

将120 只小鼠随机的分为12 组，每组10 只：正常组，咳必清组，及10个药物组，即BSS 总组、BBS-A 组、BSS-B 组、BSS-C 组、BSS-D 组的高、低剂量组。自由饮食饮水，连给药3 d。采用浓氨水喷雾法[32]，严格按照文献实验步骤进行操作，并记录每只小鼠在接受喷雾浓氨水后2 min内的咳嗽次数。

1.2.3 祛痰实验

12 组小鼠均自由饮食饮水，连给药3 d。采用小鼠气管酚红排泄实验法[32]，严格按照该文献的实验步骤进行操作，最后根据标准曲线计算出每只小鼠酚红排泄量。

1.2.4 北沙参总提取物及各萃取部位的HPLC指纹图谱色谱条件

色谱柱：岛津反相分析色谱柱（IntertSustain C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：水-甲醇（B），两相溶剂中均加入0.1%甲酸，梯度洗脱（0-8 min，5%-5%B；8-10 min，5%-15% B；10-12 min，15%-20% B；12-35 min，20%-30%B；35-45 min，30%-50%B；45-53 min，50%-75%B；53-63 min，75%-95%B；63-65 min，95%-100% B；65-80 min，100%-100% B）；进样量：30 μL；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：254 nm；柱温：30℃。

1.2.5 供试品溶液的配置

依次配置 100.0、20.0、20.0、20.0、20.0 mg·mL-1的BSS 总、BSS-A、BSS-B、BSS-C 和 BSS-D 溶液，高速离心，取上清液至棕色安培瓶中，备用。

1.2.6 统计学分析

统计学处理采用SPSS 19.0 软件，数据结果用均数±标准差（-x±s）表示，组间比较t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 北沙参总提取物及各萃取部位对模型小鼠的镇咳作用

由表1可知，与正常组比较，北沙参总提取物在低和高剂量、BBS-A 在低和高剂量、及BBS-B 在高剂量下均能显著地减少模型小鼠在2 min 内的咳嗽次数（P<0.01），即显示出较强的镇咳作用，并强于阳性对照药咳必清。此外，与正常组比较，BBS-B 在低剂量、BBS-C 在高剂量、及BBS-D 在低和高剂量下均能有效的减少模型小鼠在2 min 内的咳嗽次数，但不显示出显著性的差异性（P>0.05）。

表1 北沙参总提取物及其各萃取部位对小鼠的镇咳作用（-x ± s，n=10）

2.2 北沙参总提取物及不同萃取部位对模型小鼠的祛痰作用

由表2 可知，与正常组比较，BBS 总及其四个萃取部位（除BBS-A 低剂量）在低和高剂量下均能有效地增加模型小鼠的酚红排泄量。其中，BBS总在低剂量、BBS-A 在高剂量、BBS-B 在低和高剂量、BBS-C 在低剂量、及BBS-D 在低和高剂量下均能显著地增加模型小鼠的酚红排泄量（P<0.01 或P<0.05），即显示出较强的祛痰作用。此外，BBS-C 在低剂量下表现出最强的祛痰作用，为主要的有效部位。

2.3 北沙参总提取物及各萃取部位的HPLC指纹图谱

由图1可知，北沙参总提取物具有丰富的色谱峰，并具有较好的分离度。此外，各萃取部位之间有一定的交叉情况，可能是导致上述的镇咳、祛痰药理作用分散的重要原因。根据表1 和表2 的药理结果表明，北沙参镇咳作用的有效部位主要是极性中等偏小的部位，即石油醚和乙酸乙酯萃取部位。同时，北沙参祛痰作用的有效部位主要是中等偏大的部位，即乙酸乙酯、正丁醇部位和水部位。

3 讨论

北沙参为传统大宗中药材，药用历史悠久，体内镇咳、祛痰作用显著，可单用或配伍使用，但其相关的药效物质基础和谱-效关系仍不清楚。本研究采用经典的镇咳、祛痰小鼠模型，考察了北沙参乙醇总提取物及其四个不同极性溶剂萃取部位对模型小鼠的作用，结果表明，北沙参镇咳、祛痰的物质基础是有差异的，也存在一定的关联，即镇咳作用的有效部位主要是石油醚和乙酸乙酯萃取部位，而祛痰作用的有效部位主要是乙酸乙酯、正丁醇和水部位。屠鹏飞等[8]对市场上10种沙参类中药材进行了镇咳、祛痰作用的比较研究，表明北沙总提取物具有显著地镇咳作用，但其祛痰作用不明显。根据本实验的研究结果表明，北沙参总提取物是具有较强的祛痰作用，与文献[8]得出不一致的结论，可能是由于药材产地（山东莱阳）、采收季节、加工方式、提取溶剂（乙醇溶液）等因素所致提取获得的北沙参提取物的有效成分的数量和种类方面的差异。此外，本研究采用HPLC 技术分析了BSS 总及其四个萃取部位BSS A-D 的色谱峰，并与小鼠镇咳、祛痰试验进行了色谱峰-生物活性关联性分析，表明北沙参镇咳作用主要是极性中等及中等偏小的化学成分，而祛痰作用主要是中等及中等偏大的化学成分，造成生物活性及其分散可能与萃取的手段等过程有关。结合本课题组前期对北沙参乙醇提取物的化学成分研究表明，北沙参发挥镇咳作用的主要成分可能为聚炔类、邻苯二甲酸酯类和脂肪酸类化合物，而北沙参发挥祛痰作用的主要成分可能为β-卡巴林生物碱类、苯丙素类和简单酚酸类化合物[30]。

表2 北沙参总提取物及其各萃取部位对小鼠的祛痰作用（-x ± s，n=10）

图1 北沙参总提取物及各萃取部位的HPLC图谱

北沙参为传统大宗中药材，自1963 年以来历版《中华人民共和国药典》均有收载，但该药材的质量标准仍不完善。《香港中药材标准》（2010 年版，第三册）规定有【来源】、【性状】、【鉴别】（横切面组织特征，粉末特征，法卡林醇（falcarinol）对照的薄层鉴别，指纹图谱）、【检查】、【浸出物】、【含量测定】项，【含量测定】项中以法卡林醇（又称人参炔醇）为指标成分，采用HPLC 测定含量，规定其限量为不得低于0.023%。据文献[33-35]报道，聚炔类可能是北沙参的主要活性成分之一，为该植物中含量最高的一类成分。此外，香豆素类成分报道也很多，但该类成分的含量较低。本实验结果表明，北沙参镇咳部位的主要成分为聚炔类成分 falcarinol、falcarindiol 和(8E)-1,8-heptadecadiene-4,6-diyne-3,10-diol，进一步提示香港中药材标准2010年版中采用法卡林醇作为北沙参药材的质量控制指标具有一定的合理性。然而，对于北沙参祛痰作用的有效成分中的质量控制指标尚不清楚。此外，来源于北沙参药材中的多糖具有较强的免疫调节作用[9-11,36-38]。因此，需对北沙参药材中多糖类成分进行深入的研究，并确定其质量标准质控指标。据此，本研究结果为阐明北沙参镇咳、祛痰的物质基础奠定了基础，为该药材的质量评价的建立提供了一定的参考。