响应面法优化荞麦芽黄酮的提取工艺及其抗氧化性和稳定性的研究＊

刘 宏，夏慧敏，李 娜，刘 悦，王焕芸

（内蒙古医科大学药学院 呼和浩特 010110）

荞麦，为蓼科荞麦属（Fagopyrum esculentum Moench）植物，研究[1]显示，荞麦不仅富含蛋白质、脂肪、矿物质及维生素、碳水化合物等常规营养素，而且含有黄酮类、甾体类、萜类、木脂素类、双糖苷类、荞麦糖醇类、荞麦素类、蒽醌类、生物碱和有机酸及酯等多种具有多样生物活性物质，尤其是含有丰富的其他粮食作物所没有的黄酮化合物，因而具有很高的营养价值和药用价值，是优良的药食兼用作物。黄酮是一类重要的天然活性物质，具有止咳，平喘，祛痰，消炎，抗菌及降血糖等作用[2]，对肥胖症、糖尿病和心血管病有一定的疗效[3]，开发黄酮及相关产品具有较高的医疗保健价值。随着生活水平的提高，人们越来越注重生活质量，荞麦为原料加工的各种食品越来越受到人们的青睐。但目前对荞麦芽的研究及产品开发只限于初步阶段，目前的开发的产品种类较多，如荞麦茶、荞麦醋、荞麦啤酒、荞麦饮料以及荞麦花蜜等[4]，但多为初级加工产品，对于荞麦所含各种活性物质，如黄酮、色素、多糖、多肽保健功能的差异化利用、及各活性物质的功能没有得到充分的发挥，产品附加值较低，经济效益也不高。更多有价值的深入研究有待开发，生产荞麦芽可增加荞麦的附加值，改变荞麦以初加工产品为主的现象。

荞麦黄酮作为荞麦特有的生物活性物质，具有较高的研究开发价值，如果通过适宜的技术手段将荞麦黄酮提取加工并制成富含荞麦黄酮的保健产品，不仅可以大大提高荞麦黄酮的保健功效，同时也可为农民增收致富、企业增效，通过形成荞麦种植加工产业链带动地方经济发展。

但是，荞麦种子本身荞麦[5]黄酮含量并不高，直接用来提取黄酮成本较高。研究发现，荞麦种子经萌芽后生物类黄酮含量大幅增加，峰值含量可达种子的数十倍，但黄酮在荞麦中的含量并不是保持长期稳定，而是随着荞麦芽的生长周期呈现先增长后递减的抛物线形变化。本课题组前期对荞麦萌发过程中黄酮的对累积变化规律进行研究，研究表明荞麦种子在萌发第12 天时黄酮累积量最高，相较种子含量为29.72 mg·g-1，发芽至第 12 天时，含量可达峰值的479.90 mg·g-1，具备了很好的开发利用的物质基础。目前，有关荞麦萌芽与黄酮富集的研究较少，且仅局限于对富集情况以及不同营养条件下黄酮富集的变化[6]，对以荞麦芽为原料进行深加工的开发研究尚属空白。因此，本课题组拟以此作为研究内容，系统研究荞麦芽黄酮累积规律以及以荞麦芽为原料的黄酮提取工艺研究，并对荞麦芽提取黄酮的稳定性及抗氧化活性加以研究，为荞麦黄酮深加工的开发研究奠定基础。

目前荞麦黄酮提取工艺多采用正交试验设计，而采用响应面实验的报道较少。响应面分析法采用多元二次回归，将多因素指标的相互关系用多项式近似拟合，通过对函数响应面和等高线分析，能够精确研究各因子与响应值关系[7]。本实验以荞麦芽为实验原料，以黄酮吸光度值为指标，响应面法优化黄酮提取工艺，并通过研究荞麦芽黄酮的稳定性和抗氧化性，为荞麦芽黄酮大规模生产和开发利用提供理论依据[8]。

1 材料

1.1 仪器

SUV-9100 型紫外分光光度仪（北京瑞利公司），DZKW-5-4 电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司），YLD-2000 电热恒温鼓风干燥箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司），WK-1000A 小型高速粉碎机(滩坊市北方制药设备制造有限公司)，调温型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司），SC-3614 低速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)，AL204 型万分之一电子天平(梅特勒－托利多仪器有限公司)。

1.2 试药

荞麦种子，由内蒙古清谷新禾有机食品集团有限公司提供；无水乙醇（天津市津东天正精细化学试剂厂，分析纯）；实验用水为蒸馏水。

2 方法

2.1 对照品溶液的配制

取芦丁对照品，精密称定，置10 mL 容量瓶，用甲醇溶解，定容，制得含量为0.318 mg·mL-1的对照品溶液[9]。

2.2 供试品溶液的配制

取种植12 天的荞麦芽，干燥，研细，过60 目筛，称取 1.0 g，精密称定，置 100 mL 圆底烧瓶中，按 1∶20 的比例加入65%乙醇，60℃提取1 h，抽滤，滤液转移至100 mL量瓶，加65%乙醇稀释至刻度,摇匀，即得。

2.3 样品黄酮含量的测定

分别取对照品溶液和供试品溶液1 mL，置10 mL量瓶，加 0.3 mL 5% NaNO2溶液，摇匀，放置 6 min 后，加 10%A1(N03)3溶液0.3 mL，摇匀，放置 6 min 后，再加入4%Na0H 溶液2 mL，摇匀，用50%乙醇定容，摇匀，放置30 min，在513 nm处分别测定吸光度。

2.4 响应面分析法优化荞麦芽黄酮提取工艺

运用Design Expert 8.0 进行3 因素 3 水平 Box-Behnken 试验设计，以提取百分浓度、固液比、提取时间为考察因素，以吸光度为响应变量，进行响应面法实验设计，筛选最佳提取条件，因素及水平见表1，实验安排见表2。

2.5 荞麦芽黄酮的稳定性研究

2.5.1 pH 值对黄酮稳定性的影响

取 0.1 mol·L-1的 HCl 溶液和 0.1 mol·L-1的 NaOH溶液，配制成荞麦芽黄酮浓度为0.02%的7 种不同pH值溶液(pH 分别为2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，14.0)，室温放置5 h，观察溶液颜色变化，分别在1、2、3、4、5 h时测定 513 nm 处吸光度[10]。

表1 荞麦芽黄酮提取单因素实验安排表

表2 响应面试验因素与水平表

2.5.2 金属离子对黄酮稳定性的影响

分别配制 0.01 mol·L-1NaCl，KCl，CaSO4，AlCl3，CuSO4,CrCl3，CdSO4，FeCl3，Pb(NO3)3溶液，各取5 mL，分别加入5 mg·mL-1荞麦芽黄酮溶液5 mL，充分摇匀，室温放置5 h，测定513 nm 处吸光度[11]。

2.5.3 光照对黄酮稳定性的影响

取浓度为5 mg·mL-1荞麦芽黄酮水溶液两份，分别放置日光灯和紫外灯下50 cm 处室温照射48h，测定 513 nm 处吸光度[12]。

2.5.4 温度对黄酮稳定性的影响

取浓度为5mg·mL-1荞麦芽黄酮水溶液4 份，分别于 30℃，50℃，70℃和90℃条件下加热，冷却后测定513 nm 处吸光度[13]。

2.5.5 氧化剂和还原剂对黄酮稳定性的影响

取浓度为5 mg·mL-1荞麦芽黄酮水溶液5 份，每份5 mL，分别加入10%H2O20.4 mL，0.8 mL，1.2 mL，1.6 mL，2.0 mL，用65%乙醇溶液定容至10 mL，室温放置，定时测定513 nm 处吸光度[14]。另取浓度为5 mg·mL-1黄酮水溶液5 份，每份5 mL，分别加入10%NaHSO30.4 mL，0.8 mL，1.2 mL，1.6 mL，2.0 mL，用65%乙醇溶液定容至10 mL，室温放置，定时测定513 nm 处吸光度。以上各试验数据为三次重复，取平均值。

2.6 荞麦芽苗黄酮抗氧化性能

2.6.1 有机自由基DPPH·清除能力的测定

称取39.44 mg DPPH，用65%乙醇溶液定容至500 mL 容量瓶中，得到 0.2 mol/L DPPH 溶液；分别称取0.05 g 的荞麦芽黄酮和Vc，用65%乙醇溶液定容至500 mL 容量瓶中，得 0.1 mg•mL-1的黄酮溶液和 Vc 溶液。分别吸取 0.1 mg•mL-1黄酮溶液和 Vc 溶液 10，9，8，7，6，5，4，3，2，1 mL 置10 个10 mL 容量瓶中，65%乙醇溶液定容混匀，即得待测样品溶液与Vc溶液。

取DPPH·乙醇溶液5 mL，分别加入不同浓度的黄酮溶液和Vc 溶液5 mL，振荡器混匀后，室温，避光放置30 min，在510 nm处测定吸光度，计算清除率[15]。

清除率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

式中：

A0—DPPH·溶液5 mL+无水乙醇5 mL的吸光度

A1—DPPH·溶液5 mL+样品溶液5 mL的吸光度

A2—样品溶液5 mL+无水乙醇5 mL的吸光度

(公式中引入A2是为了消除样品溶液本身颜色对实验测定的干扰)。

2.6.2 清除超氧阴离子O2-能力测定

称取3.0285 g Tris 用蒸馏水溶解，加入114.5 mL 0.1 mol•L-1盐酸溶液与蒸馏水定容至500 mL得到pH=8.2 的 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液。称取 0.88 g 邻苯三酚，用 0.01 mol•L-1盐酸溶液溶解定容至 500 mL 得到7 mmol•L-1邻苯三酚盐酸溶液。取0.5 mL 不同浓度黄酮样品溶液，加入6 mL pH=8.2 的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，37℃水浴10 min，加入37℃预热过的7 mmol•L-1邻苯三酚盐酸溶液1 mL，混匀后反应4 min，加入5 mL浓盐酸终止反应。在紫外分光光度计325 nm 处测其吸光度A1，以等体积Tris-HCl 缓冲液座位空白测其吸光度A0。

称取0.05 g 黄酮用65%乙醇溶液定容至500 mL容量瓶中，得 0.1 mg•mL-1的黄酮溶液。取 5 mg•mL-1黄酮溶液3，4，5，6，7 mL 至10 mL 容量瓶中，65% 乙醇定容即样品溶液。量取2.1 mL 浓盐酸加蒸馏水稀释至250 mL 得到0.1 mol•L-1盐酸溶液，同法配制相同浓度的Vc 溶液作为对比组，测定吸光度，按下列公式计算清除率[16]。

清除率%＝1-A1/A0×100%

2.6.3 羟自由基·OH清除能力测定

称取13.609 g K2HPO4,加蒸馏水溶解定容至250 mL 为A 液；称取65.644 g K2HPO4,加水溶解定容至500 mL 为 B 液，以 A∶B=19∶81 比例配置，得到 pH=7.4,0.2 mol•L-1磷酸缓冲液。称取0.2478 g邻菲罗啉,加蒸馏水溶解定容至250 mL为2.5 mmol•L-1邻菲罗啉溶液。称取1.0428 g 硫酸亚铁，加水溶解定容至500 mL 为7.5 mmol•L-1硫酸亚铁溶液。

称取0.05 g 黄酮与Vc，用65%乙醇溶液定容至500 mL容量瓶中，得0.1 mg·mL-1的黄酮溶液。

取0.1 mg·mL-1黄酮溶液与 Vc 溶液10，9，8，7，6，5，4，3，2，1 mL至10个10 mL容量瓶中，用65%乙醇溶液定容至10 mL即待测样品溶液与Vc溶液。

取10个相同比色管分别加入2 mL pH=7.4,0.2 mol•L-1磷酸缓冲液，0.3 mL 2.5 mmol•L-1邻菲罗啉溶液，充分混匀后，加入 7.5 mmol•L-1硫酸亚铁溶液 0.2 mL，每加一管立即混匀，然后向其中加入1.5 mL样品溶液或Vc溶液，混匀，加入1%过氧化氢1 mL，再另做损伤管和未损伤管，其中损伤管中加入1%过氧化氢，未损伤管中不加1%过氧化氢，最后补充体积至8 mL，置37℃水浴恒温1 h，在紫外分光光度计509 nm 处测其吸光度，按下列公式计算清除率[17]。

清除率%＝[(A2-A1)/(A0-A1)]×100%(式中：A2为样品管，A0为未损伤管，A1为损伤管)

3 结果与讨论

3.1 提取单因素实验考察结果

3.1.1 浸泡时间

由图1 所示，浸泡时间对总黄酮的提取率有一定的影响,随着浸泡时间的增加,总黄酮的提取率逐渐增大；浸泡时间达到30 min 时, 总黄酮的浸提量达到最大值；随着浸泡时间继续增加, 提取率反而下降。因此,浸泡的最佳时间应为30 min。

3.1.2 固液比

由图2所示，随着固液比的增加，荞麦芽中总黄酮的提取率逐渐增大,在一定范围内提取剂用量的增加有助于黄酮物质的浸出；当料液达到1∶40 时,荞麦芽中总黄酮的的提取率达到最大值；随着提取剂用量的继续增加, 总黄酮的提取率逐渐减少。因此，最佳固液比应为1∶40。

3.1.3 乙醇百分浓度

由图3 所示，乙醇百分浓度对总黄酮的提取率影响较大,当乙醇百分浓度在30%-40%之间时,随着乙醇浓度的增大,总黄酮的提取率逐渐增大；当乙醇百分浓度为40%时, 总黄酮的提取率达到最大值；随着乙醇百分浓度继续增大,提取率反而下降。因此，乙醇百分浓度的最优值应为40%。

图1 浸泡时间考察结果

图2 固液比考察结果

图3 乙醇百分浓度考察结果

3.1.4 提取温度

由图4 所示，提取温度在30-60℃范围内，总黄酮提取率逐步随温度的升高逐步增加,当提取温度超过60℃时,总黄酮提取率略有下降,因此,最佳提取温度应为60℃。

3.1.5 提取时间

由图5所示，随着提取时间的增加，总黄酮的提取率增大，当提取时间为90 min 时, 荞麦芽中总黄酮的提取率最高；而提取时间超过90 min 后, 总黄酮的提取率略有下降。因此，最佳提取时间应为90 min。

3.1.6 提取次数

由图6所示，随提取次数的增加，黄酮提取率呈现增加的趋势，提取次数为3次时，荞麦芽总黄酮的提取率最高；继续增加提取次数，则黄酮的提取率迅速下降。因此，最佳的提取次数应为3次。

3.2 响应面实验结果及方差分析

通过单因素考察实验，对影响提取率的各因素的变化规律有了基本的结论。其中，浸泡时间、提取温度、提取次数等因素的实验结果所反映的因素与提取率变化趋势之间的关系较为明确，因此分别确定其工艺参数为：浸泡时间为30 min；提取温度为60℃；提取次数为3 次。同时，为更加精准确定主要因素的最佳条件，优化提取工艺。在单因素考察基础上，对固液比、乙醇百分浓度、提取时间等因素，以响应面法设计实验，进一步优选各因素工艺参数。

3.2.1 响应面实验结果

根据响应面实验设计，荞麦芽黄酮的吸光度见表3。

3.2.2 方差分析

以提取率为响应值，用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行回归分析，得到二次多项回归方程[18-20]，式中各项系数的绝对值的大小代表各因素对提取率的影响，系数的正负代表影响的方向，对其进行方差分 析 ， Y=0.66+7.625×10-3×A-0.061×B+0.089×C+0.047×A×B-0.037×A×C+0.035×B×C-0.078×A2-0.054×B2-0.13×C2，该提取模型P＜ 0.01，模型可信度高；失拟项P>0.05，失拟项不显著，说明实验数据与模型拟合良好。根据上述回归方程作出响应面分析表4。

图4 提取温度考察结果

图5 提取时间考察结果

图6 提取次数考察结果

表3 响应面分析实验结果

3.2.3 响应面实验验证

根据Box-Behnken 软件分析实验数据并获得响应模型，保持三个因素中的一个不改变，得到乙醇浓度、固液比、提取时间之间两个因素之间的三维响应面与等高线，图8—10 是各试验因子对响应值所构成的三维空间响应面－等高线图，采用Design Expert 8.0.6软件绘制，每个曲面表示一个变量保持最佳水平时，另外2 个变量间的相互作用。AB 交互作用P 值为0.0487，表示影响极显著，说明提取浓度与提取时间之间的交互作用对荞麦芽黄酮提取率存在极大影响，AC、BC 的交互作用不显著；A 对黄酮提取率的影响不显著，B对黄酮提取率的影响极显著（P＜0.01），C对黄酮提取率的影响极显著（P＜0.01），二次方项A2、C2对黄酮提取率的影响显著。由模型分析得出的最佳提取条件为：乙醇体积分数 65.4%，料液比 1∶20，提取时间54.4 min。根据表中F值大小可知，三个因素对黄酮的提取效果的影响顺序为：乙醇浓度>固液比>提取时间。

为验证响应面最终结果，利用已优选出的实验条件进行实验，同时为了实际操作方便可行，选定乙醇百分浓度65%，料液比 1∶20，浸泡30 min，提取时间55 min，提取3 次作为最佳工艺条件进行验证实验。三次验证实验结果分别为：5.37%、5.50%、5.42%，三次重复实验平均值为5.43%，RSD=1.2%(P＜2%)，说明实测结果与理论值没有显著性差异。

3.3 荞麦芽黄酮的稳定性芽研究

3.3.1 pH值对黄酮稳定性的影响

由表 4 所示，pH=12 时，黄酮溶液在 30 min 时出现沉淀；pH=14 时，黄酮溶液在20 min 时出现沉淀。由此可知黄酮溶液在酸性条件下更稳定，而在碱性强的条件下易受到破坏。因此，荞麦芽及其黄酮制品存放时应注意避免碱性环境。

表4 回归模型方差分析

图8 时间与固液对吸光度的影响等高线及3D曲面图

3.3.2 金属离子对黄酮稳定性的影响

由表 5 所示，加入一定量的 Na+、K+、Al3+、Cu2+、Cd2+后，黄酮提取液颜色无明显变化，十分稳定，而加入 Ca2+、Cr2+、Fe3+后，颜色明显发生变化，较不稳定；黄酮溶液中加入铅离子后0.08 h 时开始出现沉淀，表明黄酮对Pb3+极为不稳定。因此，在生产加工及储藏过程中，应该避免接触或使用可能含Mg2+、Ca2+、Fe3+、Pb3+的器物及试剂。

3.3.3 光照对黄酮稳定性的影响

由表6所示，初期日光照射下降速率比紫外光快，后期日光照射下的降解速率比紫外光慢，表明该黄酮溶液光照时间短时间对紫外灯较稳定，长时间光照条件下黄酮对日光较稳定。因此，为保证其稳定性，在储存时应避免阳光直射。

3.3.4 温度对黄酮稳定性的影响

由表7所示，当受热温度低于70℃时，黄酮溶液的吸光度值基本不变，当温度大于70℃时，吸光度值逐渐增大。因此，荞麦黄酮应在低于70℃的条件下加工或保存。

3.3.5 氧化剂和还原剂对黄酮稳定性的影响

由表8、9 所示，黄酮溶液中氧化剂H2O2和还原剂NaHSO4加入量在0.4-1.2 mL 时较稳定，但随氧化剂H2O2和还原剂NaHSO3加入量的增加，黄酮溶液吸光度值均降低且降幅较大。表明氧化剂H2O2和还原剂NaHSO3均明显影响黄酮的稳定性。因此，在保存或食品加工过程中应尽量避免荞麦黄酮与氧化剂或还原剂接触或使用具有较强氧化、还原性质的辅料及添加剂。

图9 时间与乙醇浓度对吸光度的影响等高线及3D曲面图

3.4 荞麦芽黄酮抗氧化性能

3.4.1 有机自由基DPPH·清除能力的测定

由表 10 与图 10 所示，黄酮和 Vc 对 DPPH 的清除效果如图10 所示。由图10 可以看出, 随着黄酮浓度的增加, 其清除DPPH 的能力逐步增强。黄酮的抗氧化活性与Vc 的抗氧化活性趋势相同且抗氧化能力接近Vc 活性，表明荞麦芽黄酮具有一定的抗氧化活性。

3.4.2 清除超氧阴离子O2-能力测定

由表11与图11所示，黄酮与Vc 对超氧阴离子O2-的清除效果如图11 所示。由图11 可以看出, 随着黄酮浓度的增加,其清除超氧阴离子自由基(O2-·)的能力逐步增强并逐渐趋于稳定，黄酮清除超氧阴离子O2-能力和Vc 清除超氧阴离子O2-能力相近，说明荞麦芽黄酮具有一定抗氧化活性。

3.4.3 羟自由基·OH清除能力测定

由表12 与图12 所示，黄酮和Vc 对羟基自由基·OH 的清除效果如图12 所示。由图12 可以看出,随着黄酮浓度的增加,其清除羟基自由基·OH的能力逐步增强并逐渐趋于稳定，黄酮清除羟基自由基·OH 和Vc 清除羟基自由基·OH 能力相近，说明荞麦芽黄酮具有一定抗氧化活性。

3.5 讨论

3.5.1 提取工艺研究

图10 固液比与乙醇浓度对吸光度的影响等高线及3D曲面图

单因素考察实验结果中，提取率随固液比增加，呈先增长后降低趋势，可能是由于荞麦芽中除黄酮之外，存在多糖、蛋白等，随着提取液用量增大，溶解出更多的非黄酮类物质,影响黄酮类物质的溶出或溶出的黄酮部分与溶液中的杂质结合而在过滤等处理过程中损失，从而影响黄酮提取率；乙醇百分浓度增大导致提取率降低的原因可能是随着乙醇百分浓度增高,溶剂极性降低，黄酮的溶解度下降，从而影响了黄酮在提取液中的溶出；温度与提取率之间表现为随着提取温度升高，提取率由逐步增大到降低的曲线，分析其原因，可能是随着提取温度的升高,分子的运动速度加快, 细胞壁被破坏、溶剂分子渗透和溶质扩散作用增强,黄酮的溶解度也相应增大，使得黄酮自荞麦芽细胞中迅速扩散出来,但当提取温度过高，黄酮热不稳定而造成部分被破坏，从而影响了提取率。浸泡时间与提取时间的实验结果反映出如果时间过短,原料受溶剂的溶胀破坏不足，黄酮类物质溶解不够充分，随着浸泡或提取时间的延长，溶剂的渗透与溶胀作用有助于黄酮自荞麦芽向溶剂的扩散，但随着时间的过度延长，非黄酮类物质的扩散与溶出液大大增加，因而干扰了黄酮的提取；提取次数对于黄酮提取率具有一定的影响，提取次数过少，提取不完全，提取次数过多，可能在后几次的提取中提出的杂质较多，合并处理提取液的过程中，可能由于其他组分的吸附等造成黄酮含量的降低。

从响应面的实验结果，一方面可以看出固液比、乙醇百分浓度及提取时间的最佳参数与单因素考察结果存在一定差异，这是由于单因素考察是在固定其他条件的前提下，对某一单一因素进行实验研究，没有考虑因素间的相互作用对实验结果的影响，而实际上提取效果是各因素综合作用的体现。如适宜的溶剂对目标组分溶解较好，就会以较少量的溶剂溶出较多的目标组分，同时也会以较快的速度达到溶出平衡，从而减少了提取剂用量，也缩短了提取时间；另一方面，响应面结果表明提取时间对黄酮的提取率影响不显著，提取时间与提取浓度的交互作用不显著，固液比与提取浓度的交互作用不显著，为工厂化生产荞麦芽黄酮的适用性提供了依据。

表4 pH值对荞麦芽黄酮稳定性的影响

表5 金属离子对荞麦芽黄酮稳定性的影响

表6 光照对荞麦芽黄酮稳定性的影响

表7 温度对荞麦芽黄酮稳定性的影响

表8 H2O2处理对荞麦芽黄酮稳定性的影响

表9 NaHSO3处理对荞麦芽黄酮稳定性的影响

表10 不同浓度荞麦芽黄酮对DPPH自由基的清除率

表11 不同浓度荞麦芽黄酮超氧阴离子O2-的清除率

表12 不同浓度的荞麦芽黄酮羟自由基·OH的清除率

图10 荞麦芽黄酮与Vc的DPPH清除率

图11 荞麦芽黄酮与Vc超氧阴离子清除率

总之，各提取因素最佳参数的筛选与确定应依据系统的实验研究并结合原料中所含物质种类及其性质综合考虑，合理确定。

3.5.2 稳定性实验

图12 荞麦芽黄酮与Vc羟自由基·OH的清除率

金属离子对荞麦芽黄酮稳定性影响实验中发现，当加入 Ca2+、Cr2+、Fe3+后，溶液颜色明显发生变化，反映出黄酮在这几种金属离子存在的环境较不稳定。可能是由于此三种离子与黄酮中的邻二羟基发生络合反应显色，形成了有色配位物。

温度实验中发现当温度超过70℃后黄酮的稳定性变差，其原因可能是高温度破坏了黄酮结构，产生更多的酚羟基。

分别测定pH、金属离子、光照、温度、氧化剂和还原剂对于荞麦黄酮提取液稳定性的影响，测定结果表明：荞麦黄酮溶液在酸性条件下更稳定，在碱性强的条件下易受到破坏；荞麦黄酮溶液对含Mg2+、Ca2+、Fe3+、Pb3+不稳定，应避免接触含有 Mg2+、Ca2+、Fe3+、Pb3+的器物及试剂；荞麦黄酮溶液光照时间短时间对紫外灯较稳定，长时间光照条件下黄酮对日光较稳定；荞麦黄酮溶液在温度低于70℃时稳定；氧化剂 H2O2和还原剂 NaHSO3均明显影响黄酮的稳定性。

3.5.3 抗氧化性实验

通过测定荞麦黄酮提取液对DPPH 自由基、超氧阴离子O2-、羟自由基·OH 的清除能力，测定荞麦黄酮的抗氧化性，结果显示荞麦黄酮抗氧化能力趋势与Vc抗氧化能力趋势相近，表明荞麦黄酮具有一定的抗氧化能力。

4 结论

响应面试验设计优选工艺具有简便、易操作、稳定、准确可靠等特点，适用于各因素关系复杂的工艺研究，可用于优化荞麦芽黄酮提取工艺。采用Design-Expert 8.0.6 软件 Box-Benhnken 设计，分别考察提取时间、固液比、乙醇浓度。优化得到了提取效率较好的最佳组合:乙醇浓度65.4%、固液比1：20、提取时间55 min，吸光度为0.684。同时采用测定pH、金属离子、光照、温度、氧化剂和还原剂对于黄酮提取液稳定性的影响，结果表明对黄酮稳定性均有影响；测定黄酮提取液对DPPH、超氧阴离子O2-、羟自由基·OH的清除能力，以此考察荞麦黄酮的抗氧化性，结果表明荞麦黄酮抗氧化性良好，是一类具有良好应用前景的抗氧化剂，可应用于食品加工及营养制剂领域和医药日化等非食品行业，荞麦黄酮具有止咳，平喘，祛痰，消炎，抗菌及降血糖等作用，对人体有多种生理功能，对于肥胖症、糖尿病和心血管病有一定的疗效，荞麦芽黄酮的开发与应用具有广阔前景。