两种不同光热转化剂体外治疗口腔鳞状细胞癌的疗效差异对比研究

左佳鑫，李 佳，熊 屏

口腔鳞状细胞癌恶性程度高，易复发，是头颈部肿瘤患者的死亡原因之一[1-2]，患者预后不良主要包括不能彻底去除肿瘤病灶和以手术为主的治疗方式创伤极大两个原因。纳米医学利用纳米技术进行诊疗，作为一种微创诊疗方法，对改善口腔鳞状细胞癌预后具有重要临床价值[3-6]。光热治疗是指利用光热转化剂将光能转化为热能的一种治疗方法[7]，是纳米医学在癌症治疗应用中最成熟的一种治疗方法。光热转化剂可以在病灶富集，在激光照射下局部温度升高[8]，而正常组织在激光照射下升温不明显，达到杀伤肿瘤组织而减少副作用的目的。因而光热转化剂的选择在光热治疗过程中尤为重要。常用的传统有机光热转化包括几种发光团[9-11]，由于光稳定性差[12]，亟需改进或取代，因而二维纳米片[13-14]、有机半导体[15]和其他无机金属纳米颗粒[12]等新型光热转化剂迅速发展。此外，光热转化剂主要是通过增强渗透与滞留(enhance penetration and retention，EPR)效应被动靶向至肿瘤部位[16-17]，光热转化剂尺寸越小越有利于光热转化剂利用EPR效应在肿瘤部位富集[18]。在这些光热转化材料中，CuS[19]和Fe3O4[20]作为成熟的光热材料，其光热治疗效果已经在除口腔鳞状细胞癌外的多种癌症的治疗试验中得到验证，而超小型硫化铜纳米颗粒(ultra-small Cu2-xS nanoparticles，Cu2-xS NPs)[21]和四氧化三铁纳米颗粒(Fe3O4nanoparticles，Fe3O4NPs)由于尺寸小，光热转化效果好，制备简单，具有更高的应用价值，因此，Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs介导的光热治疗在口腔鳞状细胞癌治疗方面的应用具有一定的研究价值。

综上所述，为了解决口腔鳞状细胞癌的治疗难题，促进光热治疗的临床转化，我们提出探究和比较Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs介导的光热治疗在口腔鳞状细胞癌体外实验的治疗效果，通过合成Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs，比较两者的光热转化性能、光热稳定性、生物相容性、肿瘤细胞杀伤效果，评估两种光热转化剂体外治疗口腔鳞状细胞的效果，为体内试验提供实验基础，为光热治疗在口腔鳞状细胞癌治疗方面提供材料基础和临床转化依据。

1 材料与方法

1.1 材料

硫粉(99.99%，阿拉丁，上海)，乙酰丙酮铜(98%，西格玛，上海)，油胺(C18H37N，C18含量为80%～90%，西格玛)，氯仿(分析纯，上海凌峰化学有限公司)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(DSPE-PEG2000-COOH，上海芃硕生物科技有限公司)，乙酰丙酮铁(98%，阿拉丁，上海)，油酸(C18H34O2，85%，阿拉丁，上海)；口腔鳞状细胞癌细胞系OSC-19细胞(中国科学院上海细胞库提供)，细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)。

超声清洗机，高速离心机，透射电镜(JEM-2100F，日本电子株式会社)，无菌恒温培养箱，酶标仪，近红外激光器(波长为1 064 nm)，红外相机等。

1.2 实验方法

1.2.1 Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的制备 Cu2-xS NPs的合成过程如下：将硫粉加入油胺中，并置于70 ℃磁力搅拌水浴锅中搅拌，当溶液变为棕红色且无固体残留时，将溶解在油胺和氯仿混合溶液的乙酰丙酮铜快速滴加到上述棕红色溶液中，保持在70 ℃继续搅拌，待溶液变为墨绿色，说明有Cu2-xS NPs产生。 然后加入乙醇以终止反应，通过高速离心收集产物，用乙醇、氯仿混合溶液洗涤3次，收集产物，得到的产物与DSPE-PEG2000-COOH按照1∶5的质量比溶解在氯仿中，然后在60 ℃下悬蒸1 h去除溶剂，加入去离子水超声溶解，过滤即得到Cu2-xS NPs。

Fe3O4NPs的合成过程如下：将乙酰丙酮铁、油胺和油酸的混合物置于三口烧瓶中，接空气冷凝管，真空-氩气循环3次。将混合溶液的温度升高至120 ℃，搅拌溶解，保持2 h，随后继续升温至220 ℃，保持30 min，最后将溶液温度升高至300 ℃，维持30 min，反应结束后，室温冷却至常温，超声收集产物，加入乙醇离心3次，收集产物，得到的产物与DSPE-PEG2000-COOH按照1∶5的质量比溶解在氯仿中，然后在60 ℃下悬蒸1 h去除溶剂，加入去离子水超声溶解，过滤即得到Fe3O4NPs。

1.2.2 Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的光热效应 设置不同浓度(0(去离子水)、10、20、40和80 μg/mL)的Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs水溶液，NIR激光下照射，用红外热像仪记录NIR激光照射5 min内的温度变化。通过记录Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的升温-降温循环探究二者的光热稳定性，在近红外(near-infrared, NIR)激光(激光参数：波长为1 064 nm，脉冲功率为1.5 W/cm)照射5 min后关闭激光，使溶液温度逐渐降至室温(约5 min)为一个循环，即升温-降温循环，分别将浓度为40 μg/mL的Cu2-xS NP和Fe3O4NPs水溶液重复5个升温-降温循环，记录温度变化。

1.2.3 Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs针对口腔鳞状细胞癌的体外治疗 利用CCK-8法对光热转化剂的细胞毒性和体外光热治疗对OSC-19细胞活性的影响进行评估。首先将OSC-19细胞接种到4块96孔板中培养24 h贴壁。然后，分别用含有Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的培养基(Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的浓度：0、10、20、40、80和160 μg/mL)代替原始培养基。4块96孔板继续在无菌恒温培养箱中，分别培养24 h和48 h。随后，用CCK-8进行染色，染色1.5 h后，在酶标仪上测试吸光度(λ=450 nm)。然后将OSC-19细胞接种到2块96孔板中培养24 h贴壁。然后，分别用含有Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的培养基(Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的浓度：0、10、20、40、80和160 μg/mL)代替原始培养基，其中材料浓度为0 μg/mL是对照组，用于空白对照不做处理。其他组用NIR激光(激光参数：波长为1 064 nm，脉冲功率为1.5 W/cm，照射时间为5 min)处理后，用CCK-8进行染色，染色1.5 h后，在酶标仪上测试吸光度(λ=450 nm)。细胞活性指标用经过处理后细胞吸光度相对于未经过处理的对照组细胞吸光度的百分比表示。随后，用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察治疗后细胞的凋亡情况。将OSC-19细胞接种到3个共聚焦皿上，在无菌恒温培养箱中培养24 h贴壁，分为3组：对照组、Cu2-xS NPs组和Fe3O4NPs组，分别用1 mL新鲜培养液、含有Cu2-xS NPs(100 μg/mL)新鲜培养液和含有Fe3O4NPs(100 μg/mL)新鲜培养液替换原始培养液，用NIR激光(激光参数：波长为1 064 nm，脉冲功率为1.5 W/cm，照射时间为5 min)处理后，用钙黄绿素-AM/PI染液染色观察细胞凋亡情况。

1.3 统计分析

定量数据采用平均值±标准差来表示。根据收集数据类型，为比较Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs不同浓度对细胞活性的影响，数据进行相关性分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs的制备

合成的Cu2-xS NPs溶液为墨绿色，尺寸为5 nm左右(图1a)；Fe3O4NPs为棕褐色，尺寸为10 nm左右(图1b)。二者具有良好的稳定性和亲水性，可以在水溶液中均匀分散，有利于保存，并减少在细胞培养过程中的团聚。

a：Cu2-xS NPs；b：Fe3O4 NPs；比例尺为50 nm图1 Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs的透射电镜结构图Fig.1 Structural characterizations of Cu2-xS NPs and Fe3O4 NPs

2.2 Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs的光热效应

利用光热相机监控NIR激光照射光热转化剂引起的局部温度升高(图2a、b)和升温-降温循环稳定性(图3c、d)来评估Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的光热效应。局部温度升高(图2a、b)结果为：在NIR激光照射下，不同浓度的Cu2-xS NPs水溶液局部温度升高5～30 ℃，浓度越低局部温度上升幅度越小，浓度越高温度上升幅度越大；不同浓度的Fe3O4NPs水溶液局部温度升高4～15 ℃，温度升高程度低于Cu2-xS NPs水溶液，最高浓度为80 μg/mL的Cu2-xS NPs水溶液局部温度升高了30 ℃，而浓度为80 μg/mL的Fe3O4NPs水溶液局部温度仅升高了30 ℃。此外，体外的升温-降温循环稳定性(图2c、d)结果为Cu2-xS NPs水溶液每次升高的最高温度范围为40～45 ℃，降低的最低温度范围为30～35 ℃，Fe3O4NPs水溶液每次升高的最高温度范围为25～30 ℃，降低的最低温度范围为35～40 ℃。

2.3 Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs针对口腔鳞状细胞癌的体外治疗

为了评估Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs针对口腔鳞状细胞癌的体外治疗效果，我们将OSC-19细胞分别与Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs共孵育，以进行体外探究。首先通过CCK-8法评估制备的光热转化剂Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的细胞毒性(图3a、b)。结果显示，不同浓度的Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs在培养24 h和48 h后，细胞活性均大于90%，实验数据分散，无法画出拟合曲线且经过相关性分析(图3c)，同一材料，按照不同浓度与细胞共孵育相同时间，各组P>0.05，无统计学差异。

Cu2-xS NPs(a)和Fe3O4 NPs(b)的局部升温曲线；激光开启和关闭5个循环Cu2-xS NPs(c)和Fe3O4 NPs(d)升温和降温的光热循环曲线图2 Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs的光热效应探究Fig.2 Investigation of the photothermal performance of Cu2-xS NPs and Fe3O4 NPs

随后，评估Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs对OSC-19细胞的治疗效果(图3d、e)。实验结果显示，在NIR激光照射后，与Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs共孵育的OSC-19细胞的活性随着光热转化剂浓度的升高而逐渐降低，尤其光热转化剂最大浓度为160 μg/mL，经过Cu2-xS NPs介导的光热治疗处理OSC-19细胞的活性降低至35.35%，而Fe3O4NPs介导的光热治疗处理OSC-19细胞的活性降低至50.76%，可以画出拟合曲线(图3f)，其拟合曲线的P(Cu2-xS NPs)=0.006，P(Fe3O4 NPs)=0.028，说明有统计学意义，其中R2分别为0.825 1(Cu2-xS NPs)和0.881 1(Fe3O4NPs)。CLSM(图3g、h和i)也可以观察到在光热治疗后，死细胞(红色荧光)数量多于对照组。

a：Cu2-xS NPs的细胞毒性；b：Fe3O4 NPs的细胞毒性；c：细胞毒性实验细胞活性与材料浓度的相关性；d：Cu2-xS NPs和(e) Fe3O4 NPs介导的体外光热治疗后，OSC-19细胞的细胞活性；f：体外细胞治疗细胞活性与浓度的拟合曲线；CLSM下观察对照组(g)、Cu2-xS NPs组(h)、Fe3O4 NPs组(i)的钙黄绿素-AM / PI染液染色细胞凋亡情况；g,h和i的比例尺：100 nm图3 Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs治疗口腔鳞状细胞癌的体外实验Fig.3 In vitro cellular experiment of Cu2-xS NPs and Fe3O4 NPs against OSC-19 cells

3 讨 论

根据图4，利用热解法可以大量合成Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs(图4a)，并用于口腔鳞状细胞癌的体外光热治疗(图4b)。这种方法不仅可以快速大量制备出光热转化剂Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs，而且所制备的光热转化剂直径小，稳定性好，不仅可以单独用于光热治疗，而且可以通过物理吸附或化学结合的方法，进行不同材料的结合，以用于设计出多种协同治疗方案。

a：Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs的合成；b：不同材料针对口腔鳞状细胞癌光热治疗的体外实验图4 Cu2-xS NPs和Fe3O4 NPs的合成和治疗口腔鳞状细胞癌体外实验的示意图Fig.4 Schematic diagram of the synthesis of Cu2-xS NPs and Fe3O4 NPs in combat against oral squamous cell carcinoma in vitro

具有光热转化能力的Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs能够将NIR激光的光能转化为热量。本实验通过局部温度变化和升温-降温曲线分析，对Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的光热转化能力进行了分析，结果表明，光热转化剂硫化铜和四氧化三铁的新构型Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs的光热转化能力在分子水平存在差异，Cu2-xS NPs的光热转化能力在分子水平强于Fe3O4NPs。此外，与有机光热转化剂[12]相比，连续5个循环的加热冷却导致的Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs溶液的升温-降温变化过程中，升温-降温曲线形态变化不大，表明虽然Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs光热转化能力有差异，但是作为无机光热材料都具有良好的光热稳定性。

Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs对OSC-19细胞具有体外光热治疗作用。根据文献报道[7]，细胞毒性实验结果显示， 即使与OSC-19细胞共孵育的Cu2-xSNPs和Fe3O4NPs浓度高达160 μg/mL， 且共孵育时间长达48 h仍然没有观察到明显的细胞毒性，同一材料的不同浓度和同一浓度的不同材料对细胞活性没有影响，这表明所制备的Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs具有良好的生物相容性，可以用于进行后续的体外细胞实验。Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs对OSC-19细胞的治疗效果的评估，从拟合曲线可以看出，随着材料浓度的升高两种材料对细胞的杀伤效果明显增强，Cu2-xS NPs对OSC-19细胞的杀伤作用明显强于Fe3O4NPs；CLSM下可以直观地观察到光热治疗能杀死细胞，实验组的细胞数量小于对照组，可能是由于细胞死亡不再能很好地贴在共聚焦皿表面，在染色过程中脱落。因此在选择光热治疗的光热转化剂时，若考虑疗效，Cu2-xS NPs比Fe3O4NPs更好，为多方案协同治疗提供参考。

4 结 论

总而言之，我们通过热解法合成小尺寸光热转化剂Cu2-xS NPs和Fe3O4NPs，通过对二者的升温程度、光热稳定性、生物相容性以及针对OSC-19细胞的杀伤效果进行评估比较，发现所制备的Cu2-xS NPs具有更好的光热效应，并且对OSC-19细胞的杀伤效果(细胞活性降低至35.35%)要强于Fe3O4NPs(细胞活性降低至50.76%)，为后续口腔鳞状细胞癌的体内光热治疗提供一个实验依据，有利于后续光热治疗体内试验的进行，并为光热治疗的临床应用提供一个良好的思路和光热转化剂的选择。