模拟微重力对人HGC-27胃癌细胞生物学特性及超微结构的影响

陈正阳,孙培鸣,张 涛,徐冰心,孙宏伟,司少艳,周金莲,杨建武,崔 彦

随着我国载人航天事业的蓬勃发展，航天医学研究备受关注[1-2]。研究证实，失重环境显著影响人体的生理病理过程，这同时为我们研究肿瘤的生物学行为提供了一种新的思路[3]。据文献报道，失重对肿瘤细胞的研究主要集中在甲状腺癌、乳腺癌、结直肠癌和肺癌等；研究表明，微重力环境对肿瘤细胞的生理功能和超微结构有重要影响[4-7]。胃癌是世界第四位的常见癌症，也是第二位的癌症死亡原因[8]。本课题组前期进行模拟微重力对人HGC-27胃癌细胞代谢组学影响的研究，发现微重力细胞培养系统(the rotary cell culture system，RCCS)能够显著影响人HGC-27胃癌细胞脂类物质代谢，对HGC-27胃癌细胞的生理功能产生显著影响[9]。本实验研究RCCS模拟微重力对人HGC-27胃癌细胞增殖、细胞周期、凋亡和相关蛋白及超微结构的影响，旨在进一步丰富航天医学基础理论，为航天环境及失重暴露后胃癌机制探讨和防治提供研究思路。

1 材料与方法

1.1主要材料和仪器 人HGC-27胃癌细胞系(北京北纳创联生物技术研究院)，微载体Cytodex-3(Sigma, USA)，旋转细胞培养系统(Synthecon, USA)，透射电镜(FEI Tecnai Spirit 120 kv USA)，流式细胞仪(FACSCalibur, BD, USA)，酶标分析仪(RT-6100, Rayto, USA)，鼠单抗Bcl-2，鼠单抗Fas，兔多抗Cyclin B1，鼠单抗Cyclin D1，小鼠单抗β-Actin，HRP标记羊抗小鼠二抗及羊抗兔二抗。

1.2人HGC-27胃癌细胞培养及分组 用RPMI 1640培养基(Gibco, USA)、10%胎牛血清(Gibco, USA)、1% 100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素(Gibco, USA)配制完全培养基，将人HGC-27胃癌细胞传代后置于HERAcell 150i恒温培养箱中培养，每周换液3次。选取生长状态较好、处于4～10代对数生长期细胞，随机分为模拟微重力组(SMG)和正常重力对照组(NG)。SMG组细胞置于RCCS模拟微重力环境中培养；NG组细胞置于正常重力环境中培养。

1.3建立人HGC-27胃癌细胞RCCS微载体培养体系 每个HARV(50 ml)底部有一层有机硅膜，将配置好的完全培养基和250 mg Cytodex-3微载体充分混匀后注入HARV。计数人HGC-27胃癌细胞数量，每个HARV中加入7×106个细胞。待HARV中加入的完全培养基接近充满时，用塞子封闭注入口。用吸取完全培养基和空气的5 ml注射器排空HARV中的气泡，确认排尽气泡后用乙醇棉球消毒塞子外表面。把HARV连接到RCCS系统中并置于HERAcell 150i恒温培养箱，HARV转速设置为8 r/min。2组细胞在RCCS系统培养时间为1、3 d。

1.4样本采集 用移液管将HARV中的细胞-微载体-完全培养基混合液体转移至50 ml离心管中并静置3 min，待细胞-微载体复合物沉淀后弃去含有完全培养基的上清液。加入PBS，并用移液管吹洗细胞-微载体复合物，充分吹洗后，弃去上清液。重复上述过程3次。随后加入0.25%胰酶4 ml，置于HERAcell 150i恒温培养箱消化3 min。终止胰酶的消化后，1000 r/min离心5 min。用70 μm细胞筛过滤并1000 r/min 离心5 min后，获得SMG组人HGC-27胃癌细胞。NG组细胞弃掉培养基、PBS冲洗、加入0.25%的胰酶3 ml消化和1000 r/min离心5 min后，获得人HGC-27胃癌细胞。每组实验均进行3次生物学重复。

1.5CCK-8法检测细胞增殖 将培养1、3 d的NG组和SMG组细胞用PBS吹洗2次，1000 r/min离心5 min。配置100 μl的细胞悬液并加入到96孔板中。培养箱中培养24 h(37℃, 5%CO2)。置于培养箱中24 h。向96孔板中加入CCK-8溶液10 μl。置于HERAcell 150i恒温培养箱孵育4 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.6流式细胞仪检测细胞周期和凋亡

1.6.1细胞周期检测：2组细胞经消化离心后，置于预冷75%乙醇中，然后置于4℃环境下(24 h)。把固定好的细胞用预冷PBS 吹洗2次，2000 r/min离心5 min，加入200 μl PBS，转移至流式管中。每个流式管加入100 μl RNA酶，在37℃水浴消化30 min，加入PI溶液100 μl至终浓度100 μg/ml并用锡箔纸包住，避光4℃染色30 min后上机检测。

1.6.2细胞凋亡检测：2组细胞用不含EDTA的胰酶消化离心后用PBS吹洗2次，1000 r/min离心5 min。每个流式管中加入106个细胞，并用预冷的细胞着色缓冲液吹洗，接着用1×106/ml的Annexin V溶液重悬细胞，然后加入5 μl Annexin V-FITC溶液，混匀后在4℃环境下避光放置15 min。最后加入10 μl PI溶液，混匀后在4℃环境下避光放置5 min；然后上机检测。

1.7Western Blot法检测周期蛋白(Cyclin D1和CyclinB1)和凋亡相关蛋白(Fas和Bcl-2)表达 按1 ml裂解液加10 μl PMSF(100 mmol/L)、10 μl磷酸酶抑制剂，摇匀置于冰上。每管加入80 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min。裂解完后，用冷冻离心机12 000×g离心5 min。然后将上清液转移到0.5 ml的EP管中，置于-20℃环境中保存。用BCA试剂盒(碧云天，中国)进行蛋白定量测定。将事先制备好的SDS-PAGE胶加入电泳槽中，在各胶孔中分别加入10 μl待检测样本，当loading buffer到达分离胶底部时结束电泳。然后转膜时，夹的黑面对槽的黑面；夹的白面对槽的红面，将其放入转膜槽中，并排除气泡，在电压为80 V下，转膜60 min。在转膜结束后，用含5%的脱脂奶粉TBST室温下封闭1 h，洗涤后加入一抗(Proteintech 公司，美国)，室温下摇床孵育1～2 h。在一抗孵育结束后，TBST洗涤3次，每次10 min。同样的方法加入和处理二抗。将处理好的膜放入化学发光成像系统，然后将发光液A液、B液按1∶1配好，均匀地滴在膜上。通过增强化学发光法检测免疫印迹。

1.8透射电镜观察细胞器的变化 NG组和SMG组的细胞消化离心后获得单细胞团。向单细胞团中加入2.5%戊二醛直至没过离心管，并在室温下固定2 h。用移液器弃去2.5%戊二醛，接下来加入1%锇酸，并在室温下固定2 h。用50%、70%、90%、100%乙醇、100%丙酮依次脱水。树脂包埋、切片，最后用透射电镜观察。

2 结果

2.1细胞增殖比较 与NG组相比，SMG组第1、3天人HGC-27胃癌细胞的增殖能力显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。不同时相的SMG组细胞增殖能力明显不同，与第1天相比，SMG组人HGC-27胃癌细胞的增殖能力在第3天后显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 模拟微重力对人HGC-27胃癌细胞增殖能力的影响

2.2细胞周期 与NG组相比，SMG组第1天和第3天G0/G1期细胞比例显著减少，而G2/M期细胞比例显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。2组S期细胞比例在第1天比较差异无统计学意义(P>0.05)，第3天后SMG组S期细胞比例较NG组显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2A、2B。与NG组相比，SMG组第 1、3 天Cyclin D1和Cyclin B1表达水平显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2C。

图2 模拟微重力对人HGC-27胃癌细胞周期的影响

2.3细胞凋亡 与NG组相比，第1、3天SMG组Fas表达水平显著增加，Bcl-2表达水平显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)。与NG组相比，SMG组第1、3天凋亡细胞比例显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 模拟微重力对人HGC-27胃癌细胞凋亡的影响

2.4细胞超微结构 NG组第1天和第3天胞质内粗面内质网、线粒体形态、细胞膜、核仁均正常；SMG组第1天细胞器的变化与NG组第1天的类似。SMG组第3天细胞膜结构、线粒体形态、细胞膜、核仁正常，但胞质内粗面内质网肿胀明显、胞质中细胞空泡结构明显增加，其中，白色箭头所指的分别是肿大的粗面内质网和空泡结构。见图4。

图4 模拟微重力对人HGC-27胃癌细胞超微结构的影响

3 讨论

HGC-27细胞是日本学者Tadaatsu Akagi于1973年从1例未分化胃癌患者切除的淋巴结转移灶取材所建立的人未分化胃癌细胞系，细胞呈多角形或短梭形，以单层的形式贴壁生长，倍增时间为17 h；从形态上看，HGC-27细胞缺乏明显的腺癌细胞特征，镜下可见胞质内充满黏液，细胞核被挤压一边并呈“印戒”样；该细胞中三磷腺苷、乳酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶活性较高。研究表明，HGC-27胃癌细胞是一种理想的实验细胞[10]。

本实验结果显示，RCCS模拟微重力显著影响了人HGC-27胃癌细胞的生理功能，SMG组第1、3天HGC-27胃癌细胞的增殖能力显著降低，G0/G1期细胞比例减少，G2/M期细胞比例增加，Cyclin D1和Cyclin B1表达减少。根据文献报道，用RCCS或RPM来模拟微重力时，CDK1、CDK2、CDK4、CCND1和CCNB1的mRNA在DLD-1大肠癌细胞表达减少[11-12]。姜楠等[13]研究了失重对乳腺癌细胞的影响，其研究结果显示，RCCS模拟微重力环境下人MDA-MB-231乳腺癌细胞的超微结构发生明显变化，细胞内次级溶酶体明显增多，G0/G1期细胞比例减少，S期细胞比例增加，细胞凋亡增加。Cyclin D1和Cyclin B1在G1/S期和在G2/M期转换中起着重要作用。Cyclin D1是CCND1编码的一种蛋白，具有促进G1到S期转化的作用；Cyclin B1是第1个被发现的细胞周期蛋白，主要调节G2到M期的转化，在多种肿瘤组织中均发现存在Cyclin B1表达异常，与肿瘤侵袭、转移以及预后相关[14]。结合文献认为在RCCS微重力环境中，HGC-27胃癌细胞的细胞周期蛋白Cyclin D1和Cyclin B1表达减少，致使G2/M期阻滞，细胞增殖能力降低，而S期细胞比例增加可能与实验中失重暴露时间过短有关。

本实验结果显示，在RCCS系统培养第1、3天后，SMG组人HGC-27胃癌细胞的凋亡显著增加，凋亡蛋白Fas表达水平显著增加；而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达则显著减少，并且随RCCS模拟失重培养时间的延长，人HGC-27胃癌细胞的凋亡更显著。表明人HGC-27胃癌细胞在微重力环境中出现凋亡加重现象，这与本课题组前期对乳腺癌细胞的研究结果及其他学者对相关肿瘤细胞的研究结果一致，包括MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞、ML-1和ONCO-DG1甲状腺癌细胞、DLD-1大肠癌细胞和U251神经胶质瘤细胞等[6,13,15-18]。林晶晶等[19]研究失重对HaCaT细胞的影响，结果表明失重作为一种特殊因素可通过Caspase途径诱发细胞凋亡。因此微重力环境通过多种途径能促使肿瘤细胞加剧凋亡，这对肿瘤细胞的失重应激反应具有重要意义。

本课题组还观察到，HGC-27胃癌细胞经RCCS系统培养3 d后，超微结构发生明显变化，粗面内质网肿胀，空泡结构增加。内质网对细胞物质的合成代谢至关重要，是一系列重要的生物大分子包括蛋白质、脂类和糖类合成的重要场所。本课题组前期进行模拟微重力对人HGC-27胃癌细胞代谢组学影响的研究，发现RCCS模拟微重力显著影响人HGC-27胃癌细胞脂类物质的代谢，使磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、花生四烯酸和鞘氨酸在SMG组中显著上调，而神经鞘磷脂、磷脂酸、L-脯氨酸、肌酸、泛酸、氧化性谷胱甘肽、二磷酸腺苷和三磷腺苷显著下调，这些物质对人HGC-27胃癌细胞的生理功能产生显著的影响，进而影响到细胞增殖、周期和迁移等功能[9]。进一步印证了失重对HGC-27胃癌细胞的影响发生在超微结构层面和代谢组学水平。

综上所述，RCCS模拟微重力能够显著影响人HGC-27胃癌细胞的增殖、生长周期、凋亡及超微结构。失重对HGC-27胃癌细胞的研究结果，对丰富航天医学基础理论、为航天员长期驻留太空的医学保障思路，以及探讨失重特殊环境影响胃癌细胞病理机制等具有重要意义。