嗜热链球菌MN-002发酵乳及菌粉体内缓解小鼠疲劳功效分析

韩雨婷，陈建国，李周勇，栾少萌，康小红

(内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司， 内蒙古 呼和浩特， 011500)

疲劳综合症的症状常包括短期记忆障碍，睡眠障碍和肌肉骨骼疼痛等，严重影响人们的身心健康[1]。随着社会的快速发展，人们生活节奏也逐渐加快，长期生活压力导致人们陷入疲劳，若无法消除或缓解,会造成症状加重甚至诱发其他疾病[2-3]。因此，缓解和抵抗疲劳已经成为困扰现代人的一个热点问题。

目前关于嗜热链球菌多糖的生物活性研究较多，嗜热链球菌衍生的胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)具有潜在的抗肿瘤、抗溃疡、免疫调节和降低胆固醇的特性，有助于人类健康[4-5]。但关于嗜热链球菌缓解体力疲劳方面的研究不多，且未见其发酵乳缓解体力疲劳功效的报道。

嗜热链球菌MN-002分离于传统发酵的中国乳制品，具有高产EPS的能力[6]。MN-002菌粉和发酵乳均有提高小鼠非特异性免疫和特异性免疫功效[7]，但对于缓解疲劳方面没有进行过探索。因此，本试验以嗜热链球菌MN-002发酵乳和菌粉作为研究对象，通过小鼠运动模型，研究嗜热链球菌MN-002缓解体力疲劳的作用，以期为益生菌资源和相关产品的开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌种

嗜热链球菌MN-001、MN-002、MN-006、MN-007、MN-009和MN-012，均来源于蒙牛乳业集团研发中心菌种保藏库。

1.1.2 实验动物

实验动物为SPF级昆明小鼠，雄性，平均体重为(20±2) g，共108只，随机分为对照组、发酵乳组、菌粉组3组饲喂，购于内蒙古大学实验动物研究中心。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵乳的制备

MN-002菌株在12%(质量分数)脱脂乳培养基中活化3代，以2%接菌量接种于12%脱脂乳，于37 ℃发酵18 h，4 ℃冷却6～8 h后，在M17固体培养基培养48 h并检测发酵乳中菌落总数，利用0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)调整其菌数为1.0×109CFU/mL，按用量分装4 ℃保存备用。

1.2.2 MN-002菌粉的预处理

将MN-002菌粉在M17固体培养基培养48 h并检测发酵剂活菌数，利用0.01 mol/L、pH 7.4的PBS调整其菌数为1.0×109CFU/mL，按用量分装4 ℃保存备用。

1.2.3 产胞外多糖菌株能力检测

参照王凡等[8]的实验方法，以葡萄糖为标准溶液，葡萄糖质量浓度(μg/mL)X为横坐标，吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线。采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。

1.2.4 MN-002抗疲劳功能评价

实验动物适应性饲养7 d、待体重均达(20±2) g后将小鼠随机分为3组，分组饲喂，自由饮水，自由采食。受试组小鼠每日1次灌胃，对照组以同样的方法给予生理盐水，连续45 d，如表1所示。

本研究通过使小鼠进行负重游泳判断小鼠运动耐力的变化，并通过检测小鼠血清尿素、肝糖原、血乳酸3项指标对MN-002缓解小鼠疲劳的功效进行评估。

1.2.4.1 负重游泳实验

参考LIU等[9]的实验方法进行小鼠负重游泳实验，记录小鼠自由泳开始至死亡的时间。受试样品组负重游泳时间显著长于对照组(P<0.05)，表明可有效缓解小鼠体疲劳，标记结果呈阳性(+)。

1.2.4.2 血清尿素氮的含量测定

参考WYBENGA等[10]检测血清尿素氮的实验方法。受试样品血清尿素含量显著低于对照组(P<0.05)，表明可有效调节血清尿素氮含量，标记结果呈阳性(+)。

1.2.4.3 肝糖原

末次给予受试样品30 min后，处死小鼠，取肝脏。用蒽酮法试剂盒检测肝糖原[11]。受试样品组肝糖原含量显著高于对照组(P<0.05)，表明可有效缓解肝糖原消耗，标记结果呈阳性(+)。

1.2.4.4 血乳酸

末次给予受试样品30 min后，在30 ℃水中不负重游泳10 min。采3次血：第1次，游泳前采；第2次，游泳10 min后；第3次，休息20 min后。用乳酸试剂盒检测血乳酸。计算3个时间点血乳酸曲线下面积。受试样品组曲线下面积显著小于对照组(P<0.05)，表明可有效缓解血乳酸产生，标记结果呈阳性(+)[12]。

缓解疲劳功效判定：负重游泳结果显示阳性(+)，且血乳酸、血清尿素氮、肝糖原3项中任意2项显示阳性(+)，可判定嗜热链球菌MN-002具有缓解体力疲劳功能。

1.3 数据处理

试验结果采用SPSS 23统计软件进行处理，采用单因素方差分析进行多组间差异比较，采用t检验进行两两比较，以P<0.05为具有统计学意义，实验数据均以x±s表示。

2 结果和分析

2.1 菌株产EPS能力

2.1.1 标准曲线

由图1可获得葡萄糖标准曲线方程为y=0.008 1x+0.004 3，R2=0.999 2。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

2.1.2 菌株产胞外多糖检测

如表2所示，6株菌的胞外多糖产量均达到90 mg/L，其中，嗜热链球菌MN-002具有最强的产胞外多糖能力，其发酵液中EPS的含量达到了(495.72±15.86) μg/mL，约是其他菌株产量的5倍。

表2 菌株的EPS产量 单位：μg/mL

2.2 MN-002发酵乳及菌粉对小鼠体重的影响

由表3和图2可知。3组小鼠的体重在饲喂期间不断升高，45 d均增重约20 g，且3组间各时间点的体重都没有显著性差异，上升趋势几乎一致，结果表明，发酵乳和菌粉安全无毒，而且无其他增肥等不良效果。

表3 小鼠体重记录表 单位：g

图2 饲喂期间小鼠体重变化曲线(N=12)Fig.2 Weight curve of mouse during feeding(N=12)

2.3 负重游泳实验

对运动耐力的调节作用是缓解疲劳能力加强的直接表现，游泳时间直接反映了小鼠的疲劳程度。由图3可知，MN-002发酵乳和MN-002菌粉实验组小鼠负重游泳时间均显著长于对照组(P<0.05)，比对照组分别延长了1.08 min和2.95 min；同时菌粉组小鼠负重游泳时间显著长于发酵乳组(P<0.05)。发酵乳组和菌粉组负重游泳实验均显示为阳性，而且菌粉组要比发酵组具备更优的抗疲劳能力。

图3 小鼠游泳时间变化Fig.3 Swimming time of mouse注：N=12；*代表本组与对照组相比有显著差异(P<0.05)；#代表本组分别与对照组、MN-002发酵乳组相比有显著差异(P<0.05)(下同)

2.4 肝糖原实验

由图4可知，发酵乳实验组和菌粉实验组肝糖原含量显著高于对照组(P<0.05)，分别有59.9%和88.0%的增量；此外，菌粉组肝糖原含量比发酵乳组显著高出17.5%(P<0.05)。发酵乳组和菌粉组肝糖原实验均显示阳性，但菌粉抗疲劳效果略优于发酵乳。

图4 肝糖原含量变化Fig.4 Hepatic glycogen content changes

2.5 血清尿素氮实验

图5结果显示MN-002发酵乳和菌粉组小鼠的血清尿素氮均显著低于对照组(P<0.05)，分别比对照组降低了25.4%和15.6%；而且发酵乳组与菌粉组的血清尿素氮含量水平并没有显著差异(P>0.05)。该结果表明，发酵乳组和菌粉组血清尿素氮实验结果均显示为阳性，且发酵乳和菌粉调节血清尿素含量的效果相近。

图5 血清中尿素含量变化Fig.5 Changes in serum urea content注：N=12；*表示本组与对照相比差异显著(P<0.05)(下同)

2.6 血乳酸实验

由图6可知，发酵乳实验组血乳酸曲线下面积显著降低了7.2%(P<0.05)；菌粉实验组血乳酸曲线面积与对照组相比也显著降低(P<0.05)。菌粉和发酵乳显著降低血乳酸含量。

综上，得出判定结果如表4所示，MN-002菌粉和发酵乳组负重实验及3项辅助生化指标均显著变化，因此，MN-002菌粉和发酵乳的抗疲劳结果均判定为阳性。

图6 血乳酸曲线下面积柱形图Fig.6 Area column chart under blood lactate curve

表4 试验结果判定表Table 4 Result determination

3 讨论

疲劳的定义是工作学习过程中执行能力降低和达成效率降低的状态。同时会伴随身体或心理疲惫的感觉[9]，而运动则是导致身体疲劳的关键因素之一。运动耐力直接且客观反映了疲劳程度[13]，负重游泳试验结果表明，发酵乳和菌粉组小鼠负重游泳时间较对照组显著延长(P<0.05)，说明嗜热链球菌MN-002能够提高小鼠的运动耐力，具有一定的延缓疲劳活性，同时，其作为菌粉的抗体力疲劳效果显著优于发酵乳。

肌糖原的分解是运动能量的初始来源，剧烈运动会产生能量耗尽，后期的能量则主要来自肝糖原[14]。肝糖原是疲劳状态的敏感指标。结果显示，嗜热链球菌MN-002可减缓运动过程中肝糖原消耗，进而延缓疲劳产生，提高运动耐受力，有助于改善运动的代谢控制和能量代谢的激活[15]。同样，菌粉组的调节效果显著优于发酵乳，与负重游泳实验结果相一致。肝糖原的积累可能是导致运动耐受能力增加的关键因素。

通过无氧糖酵解，运动过程中获取能量的同时，体内会产生和积累大量代谢产物，包括乳酸[16]。尿素在肝脏中形成，是蛋白质代谢的最终产物，其含量与运动耐量呈现负相关关系。即血清尿素含量越高，表明机体适应运动耐受性越弱[17]。因此，血乳酸和血清尿素氮都是缓解疲劳的重要检测指标。发酵乳组血清尿素氮和血乳酸含量显著下降，说明MN-002发酵乳和菌粉有效降低了蛋白质的分解代谢，延缓了乳酸在体内的堆积，增加了运动负荷的适应能力，加速代谢产物清除，促进疲劳恢复。

嗜热链球菌MN-002可产生大量EPS，是其他菌株产量的近5倍，包含76%～81%的酸性EPS和12%～16%的中性EPS。多糖具有调节免疫、抗疲劳、抗肿瘤、抗氧化等生物活性[18-21]，可通过促进糖原合成、减少运动代谢产物、增加耐缺氧能力等来提高机体的抗疲劳能力，对于预防与消除运动性疲劳有重要作用[22]。枸杞、五味子和黄芪多糖对正常小鼠具有抗疲劳效果，最低有效剂量均<50 mg/(kg·d)，而人参、土党参和黄秋葵多糖的有效剂量均为100 mg/(kg·d)[23-26]。推测EPS可能是嗜热链球菌MN-002提高小鼠运动耐力、增加肝脏中肝糖元储备量、降低血乳酸、血清尿素氮含量的功能因子，其发挥功能的具体分子机制需要进一步探究。

4 结论

综上所述，6株乳酸菌中嗜热链球菌MN-002产胞外多糖能力最强，高达495.72 μg/mL，显著高于其他菌株；在不影响小鼠体重的前提下，高产胞外多糖的MN-002发酵乳和菌粉均有缓解小鼠体力疲劳的功效，活菌数有效剂量均为2×108CFU/d；相较于发酵乳组，菌粉组抗疲劳和调节肝糖原的效果更优，而发酵乳组调节血乳酸的效果更好，它为嗜热链球菌MN-002的应用及产品开发奠定了基础。