响应面优化石榴皮安石榴苷提取工艺及其抗氧化活性研究

常占瑛，刘桂花，古丽巴合尔·卡吾力，开维赛尔阿娅·阿卜力克木，高晓黎，*

（1.新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐830011；2.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐830004）

作为一种重要的食用水果，石榴（Punicagranatum L.）又名安石榴、山力叶、丹若等，落叶乔木或灌木；单叶，通常对生或簇生，无托叶。石榴皮收录于中国药典，具有润肠止泻、止血、驱虫的功效。石榴皮中的生物活性化合物非常多，如鞣质类（石榴皮中鞣质的含量高达25%～30%）[1]、类黄酮及原花青素类化合物，其中安石榴苷是石榴皮鞣质中重要的成分[2]，含量在10%左右[3]。安石榴苷为棕黄色不定型粉末，极性强，易溶于水，可溶于乙醇等有机溶剂，能跟多种化学试剂发生显色反应，是逆没食子酸鞣质的一种，分子式为C48H28O30，相对分子质量为1 084.72，存在一对同分异构体，并且二者能够相互转换[4]。安石榴苷具有最强的抗氧化性[5-6]、抗癌细胞增殖[7]、抗肿瘤[5]以及降血脂作用[8]等。

目前石榴皮多酚的提取主要以回流提取[9]、浸提[10]、微波辅助提取[11-13]、超声波辅助提取[14-15]等方法为主，而以安石榴苷含量为指标，采用超声波辅助提取较少，本试验采用Box-behnken响应面设计利用超声波辅助提取安石榴苷工艺进行优化。并通过测定安石榴苷提取物清除DPPH自由基、羟自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（·O2-）以及ABTS+·4种自由基的能力，分析其抗氧化活性，以期为安石榴苷更广泛和深入的研究提供技术参考和理论依据，促进安石榴苷进一步开发应用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

和田石榴皮（阴干）：和田市麦迪森维吾尔医药公司，经新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴定为石榴科石榴属石榴Punicagranatum L.的果皮。

安石榴苷对照品 （纯度大于98.82%，批号：MUST-18030501）：成都曼斯特生物科技有限公司；三氟乙酸：成都市科隆化学品有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液：上海源叶生物科技有限公司；水杨酸：天津市北联精细化学品开发有限公司；30%H2O2溶液：天津市大茂化学试剂厂；DPPH试剂：梯希爱化成工业发展有限公司；硫酸铁、三氯化铁：天津市致远化学试剂有限公司；抗坏血酸、ABTS试剂：北京索莱宝科技有限公司；过硫酸钾：上海山浦化工有限公司。以上均为分析纯。

Agilent-1220高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；FW135型高速万能粉碎机：北京市永光明医疗仪器有限公司；New Classic MF分析天平、LE104E/02电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ500DE型超声波清洗器：江苏省昆山市超声仪器；SHB-Ш循环水式真空泵：郑州长城科工贸有限公司；Milli-Q艾柯超纯水仪：美国密理博公司。

1.2 方法

1.2.1 安石榴苷的含量测定

1.2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为0.1%三氟乙酸∶甲醇，梯度洗脱条件：0～10min，95% ∶5%；10 min～25 min，80% ∶20%；25 min～35 min，55% ∶45%；35 min～45 min，35% ∶65%；检测波长370 nm；流速 1 mL/min；进样量 10 μL；柱温 30 ℃[16]。

1.2.1.2 对照品溶液的制备

称取安石榴苷对照品6.06 mg，置10 mL容量瓶中，加入60%乙醇待全部溶解后定容，倍量稀释。用0.22 μm的微孔滤膜过滤，备用。

1.2.1.3 供试品溶液的制备

称取适量石榴皮粉末，加入一定量乙醇，超声处理，提取次数，过滤，合并滤液倒入250 mL容量瓶中，定容至刻度；倍量稀释。用0.22 μm的微孔滤膜过滤，备用。

1.2.1.4 线性关系考察

将对照品储备液倍量稀释，配制成不同浓度的水溶液，进样10 μL，以峰面积对浓度进行线性回归，得回归方程：y=70 502x+348 994，R2=0.998 4，安石榴苷浓度在4.734 μg/mL～303.0 μg/mL范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

1.2.2 单因素试验

在乙醇浓度分别为0%、20%、40%、60%、80%，料液比分别为 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL），提取时间 15、30、45、60 min，超声功率 80、120、160、200 W，提取次数1、2、3次的条件下，按照1.2.1.3的方法，进行乙醇浓度、料液比、提取时间、超声功率、提取次数5个因素对提取石榴皮安石榴苷含量的影响试验。

1.2.3 响应面法优化石榴皮安石榴苷超声提取工艺的试验设计

在单因素试验结果上，采用响应面法，对超声辅助提取石榴皮安石榴苷的影响因素进行研究和条件优化，做出响应面图，建模并分析各因素对响应值的影响[17-18]。

1.2.4 安石榴苷提取物体外抗氧化性试验

1.2.4.1 安石榴苷提取物对DPPH自由基清除作用

参考李珊珊等[19]的方法测定，以VC为对照，测定安石榴苷提取物对DPPH自由基的清除作用。

1.2.4.2 安石榴苷提取物对·OH清除作用

参考张婉君等[20]的方法测定，以VC为对照，测定安石榴苷提取物对·OH的清除作用。

1.2.4.3 安石榴苷提取物对·O2-清除作用

参考廖国会等[21]的方法测定，以VC为对照，测定安石榴苷提取物对·O2-的清除作用。

1.2.4.4 安石榴苷提取物对ABTS+自由基清除作用

参考李卓瓦等[22]的方法测定，以VC为对照，测定石榴皮安石榴苷提取物对ABTS+自由基的清除作用。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）方法的建立

测定安石榴苷粗提样品和对照品的色谱图如图1所示。

图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度的考察

在料液比 1 ∶25（g/mL）、提取 30 min、提取 1 次、超声功率为200 W的条件下，乙醇浓度对石榴皮安石榴苷含量的影响结果见图2。

图2 乙醇浓度对石榴皮安石榴苷含量的影响Fig.2 Effects of ethanol concentration on the content of punicalagin in pomegranate peel

由图2可知，乙醇浓度对安石榴苷浓度大小有显著影响，随着乙醇浓度的增大，安石榴苷提取率先升高后降低。其中乙醇浓度为60%时安石榴苷含量最高，因此选择60%的乙醇作为提取溶剂进行后续试验。

2.2.2 料液比的考察

在60%的乙醇、提取30 min、提取1次、超声功率为200 W的条件下，料液比对石榴皮安石榴苷含量的影响结果见图3。

图3 料液比对石榴皮安石榴苷含量的影响Fig.3 Effects of solid/liquid ratio on the content of punicalagin in pomegranate peel

由图3可知，料液比对安石榴苷浓度大小有显著影响，在料液比为1∶25（g/mL）之前，随着溶剂的增加，安石榴苷含量逐渐增大，料液比为1∶30（g/mL）时与1∶25（g/mL）时差别不大，但考虑到试剂与环保等问题，选择料液比1∶25（g/mL）进行后续试验。

2.2.3 提取时间的考察

在60%的乙醇、料液比1∶25（g/mL）、提取1次、超声功率为200 W的条件下，提取时间对石榴皮安石榴苷含量的影响结果见图4。

由图4可知，提取时间对安石榴苷含量大小有显著影响，45 min以后安石榴苷的含量有所下降，可能是随着时间的延长，安石榴苷降解。因此选择提取时间为45 min进行后续试验。

图4 提取时间对石榴皮安石榴苷含量的影响Fig.4 Effects of extracting time on the content of punicalagin in pomegranate peel

2.2.4 超声功率的考察

在60%的乙醇、料液比 1∶25（g/mL）、提取 45 min、提取1次的条件下，超声功率对石榴皮安石榴苷含量的影响结果见图5。

图5 提取功率对石榴皮安石榴苷含量的影响Fig.5 Effects of extraction of power on the content of punicalagin in pomegranate peel

由图5可知，安石榴苷含量随着提取功率的增大而缓慢升高，其中200 W时安石榴苷含量相对较高，因此后续试验中选择超声功率200 W。

2.2.5 提取次数的考察

在60%的乙醇、料液比 1∶25（g/mL）、提取 45 min、超声功率为200 W的条件下，提取次数对石榴皮安石榴苷含量的影响结果见图6。

图6 提取次数对石榴皮安石榴苷含量的影响Fig.6 Effects of extraction times on the content of punicalagin in pomegranate peel

由图6可知，提取次数对安石榴苷浓度大小几乎没有影响，随着提取次数的增加，安石榴苷含量略有降低，可能是在过滤时有损耗，其中提取1次时安石榴苷含量相对最高，因此后续试验提取1次。

综上所述，以上因素都能影响石榴皮中安石榴苷提取浓度大小，结合单因素试验结果，在后续响应面试验中选取对安石榴苷提取浓度影响显著的3个因素，即乙醇浓度、提取时间和料液比，在最优范围分别设置3个水平进行响应面优化。

2.3 响应面试验

根据单因素试验结果，选取对安石榴苷提取浓度影响显著的3个因素，每个自变量选择3个水平，以-1、0、1进行编码，采用Box-behnken中心组合试验设计原理，以安石榴苷的浓度为响应值进行三因素三水平的试验设计，对提取工艺进行响应面优化。响应面试验设计因素与水平编码见表1，试验设计及结果见表2。

表1 响应曲面试验设计因素水平Table 1 Factors and levels of response surface test design

表2 响应曲面试验方案及结果Table 2 Design and result for response surface experiment

应用Design-expert 8.0.6软件处理表2数据，经回归拟合得到安石榴苷超声波提取工艺条件的回归方程。

对回归方程进行回归分析，结果见表3所示。

表3 响应曲面回归方程模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the fitted regression model

由方差分析可以看出，模型P值＜0.000 1，表明该模型方程高度显著。模型失拟项P值0.105 2＞0.05，模型失拟项不显著，说明该回归模型与试验数据拟合程度较高，试验误差较小，可以用该模型分析石榴皮中安石榴苷含量提取工艺。且模型拟合度R2=0.989 7，大于90%，表明回归方程对安石榴苷浓度的预测值与实际值有比较好的相关性。在一次项的检验中，自变量A高度显著，自变量B极显著，自变量C不显著；各自变量的交互项均不显著；二次项的检验中，A2、B2达到高度显著，C2极显著。

响应面图直观地反映了任意2个因素对安石榴苷浓度的影响，具体交互影响结果见图7。

在响应面图中，响应面坡度越陡峭，则表明响应值越敏感。从响应面坡度来看，乙醇浓度与料液比和提取时间的曲线走势都比较陡峭，说明乙醇浓度对安石榴苷浓度大小的影响最显著，单个因素对安石榴苷提取率的影响大小顺序为乙醇浓度＞提取时间＞料液比，这与方差分析结果一致。响应面试验最优工艺条件为：乙醇浓度为 63.38%，1 ∶26.42（g/mL）的料液比提取40.39 min，预测安石榴苷含量为88.08 mg/g，实际操作中稍作调整，确定的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度 63%，料液比 1 ∶26（g/mL），超声提取时间 40 min。在最优工艺条件下提取3批样品，测定安石榴苷含量分别为 88.12、88.28、88.09 mg/g，与预测值相符，说明优化结果可信。

图7 响应曲面图和等高线图Fig.7 Response surface and contour chromatograms

2.4 安石榴苷提取物体外抗氧化性试验

2.4.1 安石榴苷提取物对DPPH自由基清除作用

安石榴苷提取物对DPPH自由基的清除作用，结果见图8。

图8 安石榴苷提取物及VC对DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect on DPPH free radical of punicalagin extract and VC

DPPH是一种较为稳定的自由基，广泛应用于抗氧化成分的抗氧化活性评价[23]。由图8可以看出，VC及安石榴苷提取物均对DPPH自由基有一定的清除作用，而且对DPPH自由基的清除能力均与浓度剂量有关系，安石榴苷提取物对DPPH自由基的清除能力略高于VC。DPPH自由基清除率对安石榴苷提取物、VC浓度的回归方程分别为：y=117.156 3x+38.177 7（R2=0.992 3），y=100.698 1x+36.739 5（R2=0.991 8），由此回归方程得到对应的DPPH自由基清除率50%时，所需要的VC和安石榴苷提取物浓度依次为131.7 μg/mL和 101.0 μg/mL。

2.4.2 安石榴苷提取物对·OH清除作用

安石榴苷提取物对·OH的清除作用，结果见图9。

图9 安石榴苷提取物及VC对·OH的清除作用Fig.9 Scavenging effect on·OH of punicalagin extract and VC

由图9可以看出，对照品VC与安石榴苷提取物均对·OH有一定的清除作用，而且对·OH的清除能力均与浓度有剂量关系，0.2 mg/mL浓度以上，安石榴苷提取物清除率高于VC。·OH清除率对安石榴苷提取物、VC浓度的回归方程分别为：y=185.1587x+7.9876（R2=0.9964），y=59.125 5x+24.380 5（R2=0.997 4），由此回归方程得到对应的·OH清除率50%时，所需要的VC和安石榴苷提取物浓度依次为433.4 μg/mL和227.0 μg/mL。

2.4.3 安石榴苷提取物对·O2-清除作用

安石榴苷提取物对·O2-的清除作用，结果见图10。

由图10可以看出，对照品VC及安石榴苷提取物均对超氧阴离子自由基有一定的清除作用，而且对超氧阴离子自由基的清除能力均与浓度有剂量关系，其中安石榴苷提取物对超氧阴离子自由基的清除率略低于VC。超氧阴离子自由基清除率对安石榴苷提取物，VC浓度的回归方程分别为：y=150.200 1x-1.312 4（R2=0.991 6），y=148.657 3x+8.279 0（R2=0.993 3），由此回归方程得到对应的超氧阴离子自由基清除率50%时，所需要的VC和安石榴苷提取物浓度依次为280.8 μg/mL 和 341.6 μg/mL。

图10 安石榴苷提取物及VC对·O2-的清除作用Fig.10 Scavenging effect on·O2-of punicalagin extract and VC

2.4.4 安石榴苷提取物对ABTS+自由基清除作用

安石榴苷提取物对ABTS+自由基的清除作用，结果见图11。

图11 安石榴苷提取物及VC对ABTS+自由基的清除作用Fig.11 Scavenging effect on ABTS+free radical of punicalagin extract and VC

由图11可以看出，对照品VC与安石榴苷提取物均对ABTS+自由基有一定的清除作用，而且对ABTS+自由基的清除能力均与浓度有剂量关系。ABTS+自由基清除率对安石榴苷提取物、VC浓度的回归方程分别为：y=1.794 8x-14.267 7（R2=0.997 3），y=1.402 2x+1.181 1（R2=0.997 2），由此回归方程得到对应的超氧阴离子自由基清除率50%时，所需要的VC和安石榴苷提取物浓度依次为34.82 μg/mL和35.81 μg/mL。

3 结论

对石榴皮安石榴苷提取工艺进行优化，得到优化工艺条件为：乙醇浓度 63%，料液比 1∶26（g/mL），超声提取时间40 min，超声功率200 W，提取1次，在此条件下，安石榴苷含量为（88.16±0.10）mg/g。

安石榴苷做为石榴皮多酚中主要有效成份，大量研究表明石榴多酚具有抗氧化活性[24-25]。在本次试验中，安石榴苷提取物对于DPPH自由基、OH自由基清除率IC50略低于VC，而其对ABTS+自由基和超氧阴离子自由基的IC50略高于VC，表明安石榴苷提取物具有较好的清除DPPH自由基和OH自由基的能力。