预处理提高核桃肽得率及核桃肽乳饮料制备

逯晓丹，齐建勋，李俊，裴晓惠, ，陈永浩*，郝艳宾*

1. 北京市林业果树科学研究院（北京 100093）；2. 北京市园林科学研究院绿化植物育种北京市重点实验室（北京 100102）；3. 青岛农业大学食品科学与工程学院（青岛 266109）

核桃（Juglans regiaL.）为胡桃科胡桃属植物，是国家重点支持的木本粮油树种之一，2017年全国核桃种植面积超过795万 hm2，占木本粮油树种种植面积的50%以上，总产量417万 t[1]。核桃仁制油的副产物——核桃粕含有50%以上的优质蛋白，通过提取蛋白并对其进行生物酶解，可以获得具有多种活性的核桃肽，这些活性包括抗氧化活性[2-3]、降血压活性[4-5]、降血糖活性[6-7]等。

提高具有特定活性肽的得率是酶解法制备核桃肽的研究热点，在蛋白酶的选择上，碱性蛋白酶[8]、中性蛋白酶[9]、复合蛋白酶[10-11]较其他蛋白酶更易获得较高的短肽得率，通过蛋白酶的组合、优化酶解参数[12-13]，同样可以提高短肽得率，使短肽得率68%～85%[14-15]。前期研究表明，碱性蛋白酶酶解核桃蛋白，产物的水解度和短肽得率显著高于其它蛋白酶处理，短肽得率可提高至85.62%[15]。作为常用预处理方法的水浴加热、超声波处理、微波处理，应用在核桃蛋白等的制备中已见诸报道[14,16-17]，但通过预处理方法提高核桃肽得率的研究并不多。试验以木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白，采用不同预处理方法对核桃蛋白进行预处理，考察不同预处理方法对核桃肽得率的影响，并通过单因素和正交试验制备感官品质和稳定性较好的核桃肽乳饮料，以期为核桃肽的产业化生产和应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

核桃蛋白粉、核桃肽粉（实验室自制）；木瓜蛋白酶（生化试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司）；β-环状糊精、蔗糖、稳定剂等（分析纯）；全脂奶粉（市售）。

1.2 仪器与设备

PHS-3C型数字酸度计（上海鹏顺科学仪器有限公司）；HW·SY型电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表有限公司）；KDY-9830型凯氏定氮仪（北京市通润源机电技术有限责任公司）；LXJ-IIC型低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ-400DB型数控超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）；DHG 9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；JA1003型精密电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；GJB8-15高压均质机（上海东华高压均质机厂）；YXA-LS-50S高压式杀菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；TDL-5台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 核桃蛋白粉的制备[13]

取适量的核桃粕溶于水中，浸泡打浆，用1 mol/L的NaOH调pH 8.5，在55 ℃水浴锅中搅拌1 h，在转速3 200 r/min下离心10 min，撇去油层，提取上清液，上清液调至pH 4.5，在转速3 200 r/min下离心20 min，获得蛋白沉淀，用95%乙醇洗涤2次，并加入蒸馏水，调回pH 7.0，冷冻干燥备用。

1.3.2 核桃蛋白肽粉的制备

以5 g/100 mL核桃蛋白溶液经木瓜蛋白酶在优化条件下酶解，灭酶后冷却，调至pH 4.5，离心取上清液，调至pH 7.0，将上清液冷冻干燥后备用。

1.3.3 不同温度加热预处理

配制5 g/100 mL核桃蛋白溶液，分别采用不加热、50，60，70，80，90和100 ℃预处理15 min，冷却，调至pH 6.5，温度至60，加入适量的木瓜蛋白酶酶解3 h，沸水浴10 min灭酶活，冷却，调至pH 4.5，以2 000 r/min离心5 min，取上清液，调至pH 7.0，分别测定其短肽得率。

1.3.4 不同加热时间预处理

将5 g/100 mL核桃蛋白溶液在一定温度下加热预处理0，15，30，45，60，75和90 min，然后冷却，参照1.3.3的工艺参数，采用木瓜蛋白酶进行酶解，分别测定其短肽得率。

1.3.5 不同超声时间预处理

对5 g/100 mL核桃蛋白溶液进行超声预处理，超声波功率400 W，处理时间分别为0，2，4，6，8，10和12 min，参照1.3.3的工艺参数，采用木瓜蛋白酶进行酶解，分别测定其短肽得率。

1.3.6 不同微波时间预处理

将5 g/100 mL的核桃蛋白溶液进行微波预处理，微波功率800 W，加热时间分别为0，1，2，3，4，5，6和7 min，冷却，参照1.3.3的工艺参数，采用木瓜蛋白酶进行酶解，分别测定其短肽得率。

1.3.7 核桃肽得率的测定[18]

称取适量样品于烧杯中，加入10 g/100 mL TCA 25 mL，混匀，静置，定量转移。离心后取全部上清液用滤纸过滤，移取滤液于消化管中，测定其氮元素含量。

短肽得率按式（1）计算。

式中：TCA-NSI为三氯乙酸可溶性氮得率，%；N1为在10% TCA中可溶性氮，mg；N2为原料中的总氮，mg。

1.3.8 核桃肽乳饮料的制备

1.3.8.1 工艺流程

核桃肽粉→肽乳配比优化→白砂糖调味→确定稳定剂配比→均质→灌装→杀菌→核桃肽乳饮料

1.3.8.2 核桃肽乳饮料调味

在预试验的基础上，选择肽和全脂奶粉比例分别为1∶4，1∶5和1∶6，将其混合后分别溶于饮用水中，使其质量浓度达到8 g/100 mL，分别向其中添加白砂糖，使白砂糖浓度分别达到4，6和8 g/100 mL，充分搅拌，按照二因素三水平正交试验表设置9组处理，进行感官评定打分。

1.3.8.3 感官评定方法

由10位不抽烟有感官评定经验的人员，根据感官评定标准对产品色泽、滋味与苦味、口感、组织状态进行评分，满分100分。

表1 核桃肽乳感官评分标准

1.3.8.4 核桃肽乳饮料稳定性优化

选用加速离心试验，以沉淀指数作为评价指标，具体方法为：向调配好的核桃肽乳饮料中按比例加入稳定剂，混匀后，准确移取25 mL至离心管中，在3 200 r/min下离心20 min，去除上部清液，准确称取底部沉淀质量，利用式（2）计算沉淀指数。

沉淀指数=沉淀物质量（g）/25 mL饮料质量（g）×100% （2）

1.3.8.5 核桃肽乳饮料指标检验[19]

对核桃肽乳饮料进行感官检验、理化检验和微生物学检验等3个方面的检验。

2 结果与分析

2.1 加热预处理对核桃肽得率的影响

2.1.1 加热温度的影响

未加热处理的核桃蛋白由于其酶切位点都包藏于蛋白质内部，不能与蛋白酶直接接触，使得常温下处理的核桃蛋白酶解效果较差。适当的加热处理可使蛋白质变性，造成蛋白分子结构松散，三级或四级结构遭到破坏，蛋白酶作用位点暴露出来，使蛋白酶作用底物浓度增大从而提高酶解速度[20]。由图1可见，随加热温度升高，短肽得率不断提高，加热温度达到60℃以上时，短肽得率随温度升高的趋势减缓。这可能是由于加热温度过高，会阻碍酶对蛋白的水解作用，随着蛋白质结构的受热变化，二硫键和疏水键的再生使得原松散的多肽链重新结合的更加紧密[20]，减少蛋白酶作用位点的暴露。

图1 加热温度对核桃肽得率的影响

2.1.2 加热时间的影响

70 ℃条件下对核桃蛋白进行加热预处理，考察加热时间对核桃肽得率的影响。由图2可见，加热30 min以内时，核桃肽得率保持在30%～40%，表明短时加热对核桃肽得率影响不明显。加热45 min时，核桃肽得率达到最大值58.35%，之后随着时间延长，核桃肽得率呈现逐级下降趋势，这可能是由于适宜的加热时间可以使蛋白质分子结构松散，更多蛋白酶的作用位点暴露出来，而较长时间的加热预处理会使暴露的蛋白酶作用位点减少，从而导致核桃肽得率降低。

图2 加热时间对核桃肽得率的影响

2.2 超声波处理时间对核桃肽得率的影响

由图3可见，超声处理1～6 min时，核桃肽得率缓慢增加，其得率均在10%以下。超声处理7～12 min时，核桃肽得率增加速度加快，在12 min时达到最大值，为79.21%，之后随处理时间延长，核桃肽得率呈下降趋势。这主要是因为在超声波处理核桃蛋白过程中，水溶液被不断的拉伸压缩，液体承受不了压力时就会暂时的形成一个几乎真空的空洞，这些空洞到达极限，崩溃时就会释放几万个大气压的压力，同时产生局部的高温迫使蛋白质之间的肽腱断裂，促使酶作用位点暴露[20]。

图3 超声波处理时间对核桃肽得率的影响

2.3 微波处理时间对核桃肽得率的影响

由图4可见，微波处理1～10 min时，核桃肽得率呈上升趋势，前7 min核桃肽得率增加较缓慢，其得率均在10%以下，在微波处理10 min时核桃肽得率达到最大值，为96.17%。之后随着处理时间的延长，其得率呈现下降趋势。这是由于微波电场影响了蛋白质内部分子的热运动规律，使各个分子产生摩擦，造成分子间的水平搅拌，从而产生热量。与此同时，蛋白质分子的二硫键因微波的高速震动而断裂，使得蛋白质的结构变得疏松，非极性基团暴露，从而加快酶解速率[20]。

图4 微波处理时间对核桃肽得率的影响

2.4 核桃肽乳饮料的配方优化

2.4.1 核桃肽乳饮料感官性状优化

核桃肽具有特殊的苦味，与全脂奶粉混合可以改善这一感官性状，同时通过适当添加白砂糖，可以进一步改善滋味和口感。在单因素试验结果的基础上，选用肽和全脂奶粉质量比、白砂糖添加量2个因素，采用二因素三水平正交试验表进行试验组合，对每个试验组合进行感官评定，感官评分见表2。肽和全脂奶粉质量比1∶5，白砂糖添加量6%时感官评分最高。CMC、黄原胶以及单甘酯作为稳定剂，进行正交试验，确定最佳稳定剂配比。

表2 感官评分表

由表3极差分析结果可知，影响核桃肽乳饮料稳定性的主次因素顺序为黄原胶＞CMC＞单甘酯，即黄原胶对核桃肽乳饮料的稳定性影响最大，单甘酯对核桃肽乳饮料的稳定性影响最小，核桃肽乳饮料中稳定剂添加量分别为：CMC 0.05%，黄原胶0.05%，单甘酯0.3%。经均质、灭菌后，得到感官品质和稳定性较好的核桃肽乳饮料。

表3 核桃肽乳粉稳定剂正交试验表

2.4.3 产品品质

2.4.3.1 感官指标

色泽均一，呈乳黄色；奶香味浓郁，有核桃的清香味；甜度适中可口；组织细腻，均匀无分层。

2.4.3.2 理化指标

可溶性固形物≥9%，蛋白质≥2.64%，总砷（以As计）≤0.2 mg/L，铅（Pb）≤0.3 mg/L，铜（Cu）≤5.0mg/L。

2.4.3.3 微生物指标

菌落总数≤100 CFU/mL，大肠菌数≤3 MPN/100 mL，致病菌不得检出。

3 结论

对核桃蛋白进行预处理，可有效提高酶解制备核桃肽得率。微波和超声波预处理是提高核桃肽得率的适宜方法，经微波处理10 min后，酶解制备核桃肽的得率可达97.18%，效果最好，超声波处理12 min后，酶解制备核桃肽的得率为77.57%。将核桃多肽与全脂奶粉以1∶5比例混合，制成浓度8 g/100 mL的溶液，向溶液中添加白砂糖6 g/100 mL、CMC 0.05%、黄原胶0.05%、单甘酯0.3%，经均质、灭菌可以获得感官品质和稳定性良好的核桃肽乳饮料。