地胆草提取物清除亚硝酸盐的作用

范琼，赵敏，王晓刚，邓爱妮，叶海辉

1. 中国热带农业科学院分析测试中心（海口 571101）；2. 海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室（海口 571101）

食物中亚硝酸盐和硝酸盐的含量与人类健康有着密切的关系，硝酸盐自身对人体危害不大，常作为食品添加剂被广泛用于食品加工中，但它在人或动物体内容易被还原成亚硝酸盐，在胃液中亚硝酸盐容易能与次级胺合成N-亚硝胺[1]。N-亚硝胺具有很强的致癌性，其中有些化合物在一次剂量后即可诱发癌症，有些甚至能穿过胎盘屏障给后代诱发肿瘤[2]。绿叶蔬菜也是膳食硝酸盐的主要来源，可以通过硝化细菌在胃中还原成亚硝酸盐[3]。中国的养生文化素来讲求药食同源，将中草药作为膳食食材与蔬菜肉类一起烹饪，既可以保持蔬菜肉类的新鲜度和口感，又可以提高食品营养安全，因此寻找安全有效清除亚硝酸盐或抑制亚硝化反应的中草药已成为食品应用领域的研究热点之一[4]。目前已有研究表明某些药食同源的中草药如金银花、仙鹤草、何首乌、冰糖草、红冬蛇菰等[5-9]均具有清除亚硝酸盐、抑制亚硝胺合成的作用。

地胆草（Elephantopus scaberLinn.）为菊科地胆草的带根全草，又名苦地胆、土公英、磨地胆等[10]。地胆草有凉血、清热、解毒、利湿之功效，自古以来作为传统药物在国内外民间被广泛应用。现代药理学研究证实，地胆草主要含有萜类、黄酮类、甾体类等化合物[11]，具有保肝、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗高血压、抑制黑色素等[12-13]生物活性，但是目前鲜见有地胆草清除亚硝酸盐相关研究报道。此次试验以地胆草为研究对象，对其清除亚硝酸盐效果进行了初步探究，并通过正交试验确定了地胆草提取物清除亚硝酸盐的最佳条件，为地胆草进一步开发利用提供科学依据和数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

地胆草全草，购于海南省儋州市红旗市场，经鉴定为地胆草全草。将地胆草全草洗净晾干，置75 ℃烘箱内烘干，研磨粉碎后过孔径0.150 mm筛，存于干燥阴凉处，备用。

盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸、亚硝酸钠均为国产分析纯。

植物粉碎机；SHZ-B水浴恒温振荡器（常州诺基仪器有限公司）；FD53热风循环式烘箱（德国Binder宾得公司）；离心机（上海安亭科学仪器厂）；AE200型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；UV-3900紫外可见分光光度计（日本岛津公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 亚硝酸盐清除率的测定

吸取2份2 mL 5 μg/mL亚硝酸钠标准溶液，分别置于25 mL比色管中，其中1份加入10 mL地胆草提取液，另1份加入10 mL提取剂，2份摇匀反应10 min后，均加入2 mL 0.4%对氨基苯磺酸，摇匀反应4 min后，加入1 mL 0.2%盐酸萘乙二胺，定容至25 mL后摇匀，在室温下反应15 min，以4 000 r/min离心5 min，在最大吸收波长538 nm处测定吸光度，并以式（1）计算清除率。

式中：A0为提取溶剂和亚硝酸钠反应的吸光度；Ai为地胆草提取液与亚硝酸钠反应的吸光度；Aj为对照试验反应的吸光度。

1.2.2 提取工艺对亚硝酸盐清除率的影响

1.2.2.1 浸提溶剂对亚硝酸盐清除率的影响

准确称取4份地胆草粉末，每份10 g，分别加入200 mL蒸馏水、80%甲醇、80%乙醇、80%丙酮提取剂，室温振荡24 h，取出后离心过滤，所得滤液用提取溶剂定容到200 mL，即为地胆草不同提取液。按照1.2.1试验方法测其对亚硝酸盐的清除效果。

1.2.2.2 料液比对亚硝酸盐清除率的影响

准确称取4份地胆草粉末，每份10 g，以1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）比例量取蒸馏水，在室温中振荡24 h，取出后离心过滤，所得滤液用蒸馏水分别定容至100，150，200和250 mL，所得滤液为不同料液比的地胆草水提取液。按照1.2.1试验方法测其对亚硝酸盐的清除效果。

1.2.3 反应条件对亚硝酸盐清除率的影响

1.2.3.1 提取液用量对亚硝酸盐清除率的影响

分别吸取1，2，5，7和10 mL的地胆草水提取液，其余步骤按照1.2.1试验方法测其对亚硝酸盐的清除效果。

1.2.3.2 反应温度对亚硝酸盐清除率的影响

按照1.2.1的试验方法，分别在30，40，60，80和100 ℃下反应15 min，在最大吸收波长538 nm处测定其吸光度，测定不同温度下的亚硝酸盐清除率。

1.2.3.3 反应时间对亚硝酸盐清除率的影响

按照1.2.1的试验方法，在室温下分别反应15，30，45，60和120 min，在最大吸收波长538 nm处测定其吸光度，测定不同反应时间下亚硝盐清除率。

1.2.3.4 反应pH对亚硝酸盐清除率的影响

按照1.2.1的试验方法，在pH分别为1.2，3和7下室温反应15 min，在最大吸收波长538 nm处测定其吸光度，测定不同反应pH下亚硝盐清除率。

1.2.4 正交试验

在单因素试验的基础上，用L9(33)正交试验对料液比、反应温度、pH进行试验，研究其对地胆草清除亚硝酸盐效果的影响，并明确其影响清除效果的主次，确定最佳反应条件。其因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.2.5 数据分析

所有试验数据以3次试验的x±s表示。数据用Excel 2007软件进行单因素方差分析，p＜0.05表示显著性差异，p＜0.01表示极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂对亚硝酸盐清除率的影响

由表2可知，不同溶剂提取的地胆草提取液对亚硝酸盐的清除率不同，差异性极显著：水提取液＞80%丙酮提取液＞80%甲醇提取液＞80%乙醇提取液。地胆草水提取液的亚硝酸盐清除率达到53.95%，比地胆草有机提取液清除亚硝酸盐率高，差异性极显著。这表明地胆草清除亚硝酸盐的有效成分更易溶解于水提取剂中。

表2 不同溶剂对亚硝酸盐清除率的影响

2.2 料液比对亚硝酸盐清除率的影响

从图1中可以看出，随着料液比的增加，地胆草80%乙醇提取液、80%丙酮提取液、水提取液的亚硝酸盐清除率也相应增加。当料液比为1∶10（g/mL）时，地胆草80%乙醇提取液、80%丙酮提取液和水提取液的亚硝酸盐清除率分别为19.82%，28.00%和53.95%。料液比越高，提取液中含有的地胆草抗氧化成分越高，其清除亚硝酸盐能力越强，但是成本相应越高。

图1 地胆草提取液料液比对亚硝酸盐清除率的影响

2.3 地胆草水提取液用量对亚硝酸盐清除效果的影响

从图2中可以看出，随着水提取液用量的增加，其对亚硝酸盐的清除率增强。当水提取液用量为10 mL时，地胆草对亚硝酸盐清除率为52.90%。

图2 地胆草水提取液用量对亚硝酸盐清除率的影响

2.4 亚硝酸盐用量对亚硝酸盐清除效果的影响

从图3中可以看出，亚硝酸盐用量越大，地胆草水提取液对亚硝酸盐的清除效果越低。当亚硝酸盐用量为1 mL时，地胆草水提取液的亚硝酸盐清除率为60.07%。

图3 亚硝酸盐用量对亚硝酸盐清除率的影响

2.5 反应时间对亚硝酸盐清除效果的影响

从图4中可以看出，当反应时间为40 min时，地胆草水提取液的亚硝酸盐清除率最高，为53.48%；超过40 min，地胆草对亚硝酸盐清除效果逐渐达到平衡。

2.6 反应温度对亚硝酸盐清除效果的影响

从图5中可以看出，在30～100 ℃时，随着反应温度的增加，水提取液的亚硝酸盐清除率小幅提升，当反应温度达到60 ℃时，水提取液的亚硝酸盐清除率达到54.62%。温度升高，会促进分子运动速度，从而加快地胆草水提取物与亚硝酸盐反应速率。但是温度过高，会破坏地胆草水提取液中的有效成分，同时部分亚硝酸盐发生氧化作用，从而使亚硝酸盐清除率有所下降[14]。

图5 反应温度对地胆草水提取液亚硝酸盐清除率的影响

2.7 反应介质pH对亚硝酸盐清除率的影响

从图6中可以看出，当pH为1.2，3和7时，不同地胆草提取液的亚硝酸盐清除效果不同。当pH为1.2时，80%乙醇、80%丙酮、水提取液的亚硝酸盐清除率分别为29.0%，35.4%和54.7%；当pH为3时，80%乙醇、80%丙酮、水提取液的亚硝酸盐清除率分别为19.8%，28.0%和53.9%；当pH为7时，80%乙醇、80%丙酮、水提取液的亚硝酸盐清除率分别为10.4%，18.8%和29.2%。结果显示，反应pH越低，地胆草提取液的亚硝酸盐清除率效果越明显，这是因为在酸性条件下，亚硝酸盐易转化为亚硝酸，进而转化为N2O3，地胆草提取物可将N2O3转化为NO，因此阻断了亚硝胺的行程[15]。在相同的pH条件下，水提取液的亚硝盐清除效果比其他2种有机溶剂提取液效果更好，这与表1的结果一致。

2.8 最佳反应条件的确定

从表3中可以得出，最佳方案是A1B2C1，即料液比1∶10（g/mL），提取温度60 ℃，pH 1.2。在此条件下，对地胆草水提取液对亚硝酸盐清除效果为61.10%。其中因素C（pH）是影响亚硝酸盐清除效果的最重要因素，因素A（料液比）次之，最后是因素B（反应温度）。

表3 地胆草清除亚硝酸盐效果的正交试验表

3 讨论与结论

近年来关于地胆草生物活性的研究逐渐增多，温先敏等[16]研究表明地胆草具有较强的抗炎镇痛效果；梁侨丽等[17]研究发现从地胆草中分离出的两种倍半萜内酯化合物对人体肝癌细胞、宫颈癌细胞和结肠腺癌的生长具有抑制作用；Su等[18]研究表明地胆草提取物可以诱导并激发鼻咽癌细胞中的细胞周期阻滞与细胞凋亡；Wiwat等[19]研究发现地胆草水提取物具有抗艾滋病病毒逆转录酶活性作用；范琼等[13]研究发现地胆草具有降低高血压、抗黑色素及抗氧化等生理活性，这些生理活性与地胆草含有倍半萜内酯类、多酚类、黄酮类等活性成分息息相关。

此次试验测定了地胆草对亚硝酸盐的清除能力，并通过对地胆草不同的提取工艺和反应条件优化对亚硝酸盐的清除能力进行研究。试验结果表明，地胆草不同溶剂对亚硝酸盐的清除效果大小依次为水提取液、80%甲醇提取液、80%乙醇提取液、80%丙酮提取液；地胆草水提取液对亚硝酸盐清除率为53.95%，差异性极显著。在单一因素试验中，随着料液比和地胆草提取液用量增加，地胆草清除亚硝酸盐效果均会增强，当料液比1∶10（g/mL）时，地胆草水提取液的亚硝酸盐清除率为53.95%；当地胆草水提取液用量为10 mL时，亚硝酸盐清除率为52.90%；而在反应温度30～100 ℃条件中，反应温度为60 ℃时地胆草水提取物的亚硝酸盐清除率为最高，为54.62%，之后随着温度的升高，地胆草水提取物的亚硝酸盐清除率降低，差异性极显著。如果投入生产，料液比过高、提高地胆草用量以及反应温度均会增加前处理成本，因此选择一个最佳提取和反应方案非常重要。正交试验表明，在料液比1∶10（g/mL）、反应温度60 ℃、pH 1.2的条件下，地胆草水提取液的亚硝酸盐清除率最高，可达到61.10%。且pH是影响地胆草清除亚硝盐效果的最重要因素。人体胃酸pH在1.2～3左右，这表明地胆草在人体胃中可以发挥更佳清除亚硝酸盐效果。比较于其他中草药，例如红冬蛇菰石油醚提取物的亚硝酸盐清除率为59.35%[9]，蒲公英的亚硝酸盐清除率为49.47%，珍珠菜的亚硝酸盐清除率为20.40%[20]，说明地胆草具有较好的消除亚硝酸盐效果，不仅在药品开发，而且可以在食品加工上有很好的应用前景。